【摘 要】
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肥胖是因为机体内过多的脂肪沉积超过正常的医学状态,肥胖将会引起各种疾病,尤其是心血管疾病、II型糖尿病、脂肪肝、骨关节炎和某些类型的癌症。引起肥胖最常见的原因主要是以下三种:摄入过多的食物、体育运动的缺乏和遗传易感性;另外也有少数是由基因、内分泌失调、药物治疗或者精神障碍引起。预防肥胖的关键在于减少机体脂肪沉积。二氢杨梅素（Dihydromyricetin,DHM）是一种黄酮类化合物,具有抗氧化、
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肥胖是因为机体内过多的脂肪沉积超过正常的医学状态,肥胖将会引起各种疾病,尤其是心血管疾病、II型糖尿病、脂肪肝、骨关节炎和某些类型的癌症。引起肥胖最常见的原因主要是以下三种:摄入过多的食物、体育运动的缺乏和遗传易感性;另外也有少数是由基因、内分泌失调、药物治疗或者精神障碍引起。预防肥胖的关键在于减少机体脂肪沉积。二氢杨梅素（Dihydromyricetin,DHM）是一种黄酮类化合物,具有抗氧化、消炎、降血脂、抗脂肪肝等作用,具有巨大的药用价值。但是DHM对于肥胖的作用机制至今尚无人研究。钙离子在各种细胞和生物体的生理活动中不可或缺,它通过调节细胞内外电位平衡和相关蛋白酶的活性,例如Ca MKK2蛋白的活性。Ca MKK2作为一种钙调蛋白激酶,能够在钙离子的作用下激活AMPK。AMPK通路是调控细胞代谢的关键通路,AMPK通路的激活,将会抑制前体脂肪细胞的分化和脂质累积,也能促进脂肪细胞中的甘油三酯降解。本研究以3T3-L1小鼠前体脂肪细胞系为研究对象,在体外研究DHM对脂肪代谢的作用及其机理。首先通过HPLC检测DHM的吸收效率,再用钙离子探针和和活细胞工作站观察DHM对细胞内钙离子浓度变化的影响。接着检测DHM对细胞的毒性和增殖作用,排除因细胞活性和数量的增加或减少而影响细胞脂肪沉积。通过油红O染色、荧光定量PCR以及Western blot检测DHM对脂质沉积相关表型、m RNA和蛋白表达量的影响,从而推测DHM的作用机制。通过文献检索和KEGG通路分析,找到DHM作用因子Ca MKK2。干扰Ca MKK2后,再用DHM处理细胞后观察脂质沉积情况,检测相关蛋白表达情况,阐明DHM通过激活Ca MKK2调节细胞脂质代谢的作用机理,为未来改善机体糖脂代谢基因靶标的选择、治疗肥胖新型药物的开发奠定理论基础。本研究得到结果如下:1.DHM对3T3-L1细胞增殖以及细胞活性的影响通过不同浓度DHM处理3T3-L1细胞后,利用流式细胞术和Ed U检测细胞活性及增殖情况,发现80μM以下DHM不影响3T3-L1细胞的增殖以及细胞活性。2.不同浓度DHM对3T3-L1细胞脂质累积的作用不同浓度DHM处理诱导分化后的3T3-L1细胞,发现60μM以下的DHM不影响细胞数量的情况下抑制3T3-L1细胞分化和脂质沉积,并以60μM DHM作为后续实验浓度。3.DHM对3T3-L1细胞分化成脂的影响DHM通过抑制3T3-L1细胞分化相关m RNA和蛋白的表达,促进分化负向因子的表达,抑制3T3-L1细胞分化,抑制细胞中脂肪的沉积。4.DHM对分化后3T3-L1细胞内脂解的影响DHM促进脂肪细胞中PKA,HSL和ATGL的m RNA表达,促进成熟脂肪细胞中脂滴降解,减少脂肪沉积。5.DHM的吸收效率和对细胞内钙离子的影响HPLC结果发现3T3-L1细胞对DHM的吸收效率呈现负对数线性趋势,3 h时培养基中DHM被完全吸收;钙离子荧光探针检测发现DHM能够增加细胞质钙离子含量。6.DHM对3T3-L1细胞内CAMKK2和AMPK的影响定量结果发现DHM促进Ca MKK2的m RNA表达水平上调,Western blot发现DHM促进AMPK的磷酸化。7.干扰Ca MKK2后DHM对3T3-L1细胞分化成脂相关蛋白表达的影响STO-609干扰Ca MKK2后,AMPK磷酸化被抑制,DHM对分化、成脂和脂解相关蛋白的表达不再起作用,DHM不再影响3T3-L1细胞中脂质沉积。结论:DHM通过增加细胞质中钙离子浓度,上调Ca MKK2的m RNA的表达,促进AMPK磷酸化,从而抑制3T3-L1细胞分化、降低脂质生成以及促进细胞中脂滴的降解,从而调节细胞内脂质代谢。
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