论文部分内容阅读
许多植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)都是重要的益生乳酸菌,因其具有优良的发酵特性和卓越的益生功能而广泛地被应用于乳制品中,尤其在发酵乳制品中更为常见。γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)是哺乳动物神经中枢的一种抑制性神经递质,具有调节血压、镇静安神、促进胰岛素分泌、保护肝肾机能、预防肥胖等功能。本课题以Lb.plantarum的模式菌株Lb.plantarum ATCC14917为研究对象,首先通过单因素实验,以GABA产量为指标研究了影响菌体积累GABA的因素;再通过正交实验确定各因素对GABA产量影响的显著程度。其次,以L-谷氨酸钠(monosodium L-glutamate,LMSG)为单一诱导因素,化学限定培养基为发酵基质,建立了能够诱导GABA产量显著升高的发酵体系;最后,对特定时间点GABA产量差异最为明显的菌体细胞进行转录组测序,并对与GABA产量差异存在密切联系的基因进行定量分析、功能注释、代谢通路富集等相关生物学信息分析,从而预测由L-MSG诱导的,Lb.plantarum ATCC14917中GABA的代谢途径。通过上述研究得到以下结果:1、L-MSG浓度、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)浓度、发酵初始p H值、发酵温度能够显著影响菌体积累GABA,但钙离子浓度对其产量影响不大;正交实验结果确定上述五个因素对GABA产量影响的显著程度为:发酵初始p H值>发酵温度>L-MSG浓度>PLP浓度>Ca2+浓度。2、以L-MSG为单一诱导因素,建立的GABA产量显著升高的发酵体系为发酵初始p H值为5.5,发酵温度为37℃,L-MSG浓度为100 m M,接种量为3%,培养基体积为2 L。在此条件下,发酵36 h时,添加L-MSG发酵液中GABA含量为721.35 mM,是未添加LMSG发酵液中GABA含量的7.77倍。3、高通量转录组测序得到了由L-MSG诱导、表达量存在明显变化的87个差异基因,其中有69个显著上调基因和18个显著下调基因,主要包括磷酸转移酶编码基因、丙酮酸脱氢酶编码基因、GAD编码基因、GABA转氨酶编码基因、琥珀酸半醛脱氢酶编码基因等。这些差异基因分别与碳水化合物跨膜转运、糖-磷酸转移酶、转氨酶等功能密切相关,同时参与丙酮酸代谢、戊糖磷酸途径、脂肪酸合成、氨基酸代谢等与GABA代谢相关的生物化学过程。4、经差异基因的功能注释和代谢通路富集分析,预测了L-MSG诱导Lb.plantarum ATCC14917大量积累GABA可能的分子机制如下:①L-MSG诱导GAD编码基因gad B上调表达,促进L-MSG大量转化成GABA;②L-MSG诱导GABA转氨酶编码基因gab T下调表达,抑制GABA的分解途径,有助于GABA的积累;③L-MSG诱导葡萄糖经糖酵解、丙酸代谢等途径生成琥珀酸,琥珀酸可抑制GABA的分解途径,有助于GABA的积累;④LMSG激活了细胞质中脂肪酸的合成,增加了细胞膜的通透性,有助于细胞对物质的吸收,促进菌体细胞生长和代谢。本课题研究了影响Lb.plantarum ATCC14917积累GABA的主要因素,并利用新一代高通量测序技术实现了在转录组水平上探究Lb.plantarum ATCC14917生成GABA的分子机制,同时预测了GABA的代谢途径。本研究为从分子水平上调控Lb.plantarum发酵合成GABA、提高GABA的产量奠定了重要的理论基础,同时也为其他种属乳酸菌GABA合成机理和代谢途径的研究提供思路。