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目的分析N-糖基化修饰对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白H(CREBH)发生蛋白酶解激活的作用及调控CREBH糖基化修饰对棕榈酸(PA)诱导的肝脂肪变细胞模型中脂质代谢、脂毒性、脂质过氧化及炎症反应的影响,从而探讨N-糖基化修饰CREBH在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中的作用及意义。方法1.PA诱导肝脂肪变细胞模型的建立以AML-12小鼠肝细胞系为研究对象,采用PA诱导肝脂肪变细胞模型,通过油红O染色检测细胞内脂质水平并筛选最佳作用浓度及作用时间。2.N-糖基化修饰对CREBH分子量及蛋白激活的影响构建CREBH糖基化修饰野生型质粒载体(CREBH WT),将CREBH的N-糖基化位点413、420及427共有序列上保守的天冬氨酸残基改变为异亮氨酸以此来产生点突变作用从而构建糖基化修饰突变质粒载体,即设计m1(N413I),m2(N420I)和m3(N427I)这三个位点的突变,CREBH糖基化修饰突变体包括单点突变(m1,m2,m3),双点突变(m1+m2,m1+m3,m2+m3)及三点突变(m1+m2+m3)质粒载体。利用肽糖苷酶F(PNGase F)及采用免疫印迹法(Western blot)检测不同糖基化突变体对CREBH分子量以及蛋白表达的影响。采用免疫荧光(IF)在共聚焦显微镜下观察糖基化修饰对CREBH的细胞定位及酶解激活的影响。3.N-糖基化修饰CREBH对脂代谢相关因子PPARα和SCD-1表达的影响CREBH WT及七种突变体分别转染AML-12细胞。PA诱导AML-12细胞发生脂肪变。采用Western blot检测不同CREBH糖基化修饰突变体在肝细胞脂肪变时对CREBH分子量以及蛋白表达的影响,以及对脂代谢相关因子PPARα和SCD-1蛋白表达的影响,同时采用q RT-PCR检测各基因m RNA的表达变化。4.比较糖基化修饰、非糖基化修饰及去糖基化修饰CREBH的差异采用不同浓度以及不同作用时间的衣霉素(Tm)对转染了CREBH WT以及CREBH m1+m2+m3的AML-12细胞进行处理,比较Tm在诱导去糖基化修饰和内质网应激的不同作用及对CREBH蛋白表达的影响。另外,比较CREBH WT、CREBH m1+m2+m3分别在PA诱导和TM诱导下影响CREBH糖基化修饰的差异。5.调节CREBH糖基化修饰对肝细胞脂肪变相关因子的影响比较CREBH发生糖基化修饰、非糖基化修饰、去糖基化修饰以及高糖基化修饰对肝细胞脂肪变相关因子CREBH、PPARα和SCD-1表达的影响,并对其亚细胞定位进行观察;另外,采用q RT-PCR检测相关因子基因表达;采用酶比色法检测TG和TC的含量;采用ELISA法检测炎症因子TNF-α和IL-6以及脂质过氧化因子MDA和SOD的表达。6.N-糖基化修饰CREBH对PPARα和SCD-1的调节机制采用报告基因分析方法分析N-糖基化修饰CREBH对脂代谢相关因子PPARα和SCD-1启动子驱动作用的影响,采用免疫共沉淀方法进一步研究N-糖基化修饰CREBH对PPARα和SCD-1蛋白的相互作用。结果1.通过油红O染色观察PA以200μM处理AML-12细胞48 h后,肝细胞胞浆中均可见明显大泡状脂滴沉积(>70%),炎症浸润更加显著且肝细胞无明显大量坏死。2.通过酶切鉴定,CREBH野生型质粒载体(CREBH WT),CREBH糖基化修饰突变体包括单点突变(m1,m2,m3),双点突变(m1+m2,m1+m3,m2+m3)及三点突变(m1+m2+m3)质粒载体构建成功,单点及双点突变致使CREBH发生低糖基化修饰,三点突变造成CREBH发生非糖基化修饰。采用PNGase F酶对糖蛋白进行处理后,CREBH WT组中,CREBH分子量下降最明显(P<0.01),而CREBH m1+m2+m3组中,CREBH分子量则没有明显变化(P>0.05),单点突变以及双点突变组中CREBH分子量有所下降,介于以上二者之间。IF结果显示,PA处理后,CREBH WT组中CREBH蛋白被转移至细胞核中,且蛋白表达量减少(P<0.05),而在CREBH m1+m2+m3组中,CREBH蛋白仍然保留在内质网中,且蛋白表达无明显减少(P>0.05)。3.PA干预48小时后,CREBH WT组中CREBH蛋白表达减少(P<0.01),而CREBH m1+m2+m3组中CREBH蛋白表达无明显变化(P>0.05),单点突变和双点突变的CREBH蛋白表达介于二者之间。PNGase F处理后,CREBH WT组中CREBH蛋白表达和分子量均明显减低(P<0.01),而在CREBH m1+m2+m3组中,CREBH蛋白表达和分子量均无明显减低(P>0.05)。其他突变介于二者之间。另外,PA干预后,CREBH WT组中,PPARα蛋白及基因表达均减少(P<0.05),SCD-1蛋白及基因表达均增加(P<0.01);当CREBH发生低糖基化修饰及非糖基化修饰后,PPARα减少的更加明显而SCD-1则增加的更为明显(P<0.05),在CREBH m1+m2+m3组中的变化最为显著(P<0.01)。4.Tm采用不同浓度处理AML-12细胞6 h后,在CREBH WT组中,CREBH蛋白分子量随TM浓度升高而下降,且10μg/m L组中CREBH蛋白分子量下降及蛋白表达降低的最明显(P<0.01)。然而,在CREBH m1+m2+m3组中,CREBH蛋白表达及分子量均没有发生明显变化(P>0.05)。用10μg/m L的Tm分别在细胞收集前处理6 h、24 h和48 h,结果发现,Tm处理6 h后,CREBH WT组中CREBH蛋白分子量及表达量均减低(P<0.01);处理24 h后,CREBH蛋白表达减少,分子量也有减低但不如6 h明显(P<0.05);处理48 h后,CREBH蛋白表达明显减少(P<0.01),分子量有所减低但不如6 h减低的明显(P<0.05)。而在CREBH m1+m2+m3组中,不同时间的Tm处理后,CREBH蛋白表达及分子量均没有发生明显变化(P>0.05)。5.在CREBH WT组中,PA(200μM)处理48 h后,CREBH蛋白表达减低(P<0.01);Tm(10μg/m L)处理6 h后,CREBH分子量减低,表达量也略有减低(P<0.05);PA及Tm联合处理后,CREBH蛋白表达以及分子量与未处理组相比无明显变化(P>0.05)。在CREBH m1+m2+m3组中,无论给予PA和Tm单独处理或联合处理,CREBH蛋白表达及分子量均没有发生明显变化(P>0.05)。利用PA诱导肝脂肪变细胞模型,当CREBH经去糖基化修饰及非糖基化修饰后,PPARα大量消耗而表达减少(P<0.05),SCD-1大量生成而表达增加(P<0.05),这种变化比CREBH WT组更加明显(P<0.05)。同样,CREBH发生非糖基化修饰后,脂质代谢相关因子、炎症相关因子以及脂毒性、脂质过氧化相关因子的变化比CREBH WT更加显著(P<0.05)。当用糖基转移酶V(Gn T-V)诱导CREBH发生高糖基化修饰后,这些变化均得到明显改善(P<0.05)。6.CREBH WT可以增加PPARα启动子的转录活性以及抑制SCD-1启动子的转录活性(P<0.05),而CREBH m1+m2+m3则没有这种能力(P>0.05)。只有CREBH WT能够将PPARα或SCD-1沉淀下来,而CREBH m1+m2+m3则不行。结论1.CREBH的N-糖基化修饰定位于C端413、420、427三个氨基酸残基位点。2.N-糖基化修饰对CREBH的蛋白酶解活化必不可少。糖基化修饰的CREBH被蛋白酶解激活并转移到细胞核中,蛋白表达减低,非糖基化修饰的CREBH不能被蛋白酶解激活且无法转移到细胞核中,蛋白表达无明显变化。3.Tm有双重作用,处理6小时主要起去糖基化修饰作用,处理48小时则主要发挥内质网应激作用。去糖基化修饰以及非糖基化修饰的CREBH无法被蛋白酶解激活。N-糖基化修饰后的CREBH更容易受到PA或者Tm诱导的蛋白酶解激活的影响。Tm诱导CREBH的去糖基化修饰作用可能使PA诱导的CREBH蛋白酶解作用受到抑制。4.非糖基化修饰及去糖基化修饰CREBH均促使脂质代谢、脂毒性、炎症和脂质过氧化失调从而加重肝细胞脂肪变。Gn T-V通过诱导CREBH的高糖基化修饰对肝细胞脂肪变起保护性作用。5.N-糖基化修饰CREBH可能通过调节含有CRE元件的PPARα和SCD-1的启动子驱动作用从而转录调控这两种因子的基因表达水平,并且可与PPARα和SCD-1蛋白相互作用从而影响其功能,提示CREBH的N-糖基化修饰在调控NAFLD的发生中起关键作用。目的分析N-糖基化修饰CREBH在NAFLD动物模型中对脂质代谢、脂毒性、脂质过氧化、炎症反应等方面的影响,进一步探讨N-糖基化修饰CREBH在NAFLD中的作用机制。方法1.采用高脂饮食(HFD)喂养C57BL/6小鼠16周以及蛋氨酸和胆碱缺乏饮食(MCD)喂养C57BL/6小鼠4周构建NAFLD小鼠模型。通过小鼠尾静脉注射LV-CREBH m1+m2+m3及LV-Gn T-V慢病毒表达载体使小鼠体内过表达CREBH m1+m2+m3及Gn T-V,并设立阴性对照组(LV-NC)。2.造模结束后称量小鼠肝脏湿重,通过H&E染色及油红O染色观察肝组织形态学改变以及肝细胞内脂滴形成情况。3.Western blot以及IF检测并分析CREBH及PPARα和SCD-1蛋白表达。4.IHC检测肝组织中F4/80表达。5.q RT-PCR检测CREBH m RNA、PPARαm RNA、SCD-1 m RNA、Apo A-I m RNA、SREBP-1c m RNA和FGF21 m RNA表达。6.生化法检测肝功能ALT、AST以及TG、TC的表达。7.ELISA法检测炎症因子TNF-α和IL-6以及脂质过氧化因子MDA和SOD表达。结果1.肝脏大体形态及肝重的变化MCD模型中,小鼠肝脏体积明显缩小,肝重减轻,LV-CREBH m1+m2+m3组中肝脏体积最小,肝重最轻(P<0.01);HFD模型中,小鼠肝脏体积明显增大,肝重增加,LV-CREBH m1+m2+m3组中肝脏体积最大,肝重最重(P<0.01);LV-Gn T-V组中肝脏形态及肝重均较模型组明显改善(P<0.05)。2.NAFLD小鼠模型的鉴定H&E染色显示,超过80%的模型小鼠肝脏发生脂变并可见炎性细胞浸润;油红O染色显示模型小鼠肝细胞内出现大小不等的橘红色脂滴,以上结果均提示NAFLD造模成功。两种动物模型中,LV-CREBH m1+m2+m3组肝脏脂变较LV-NC明显加重(P<0.05),LV-Gn T-V组较LV-NC明显改善(P<0.05)。3.IHC检测肝组织中F4/80的表达模型小鼠肝组织中F4/80的表达较正常小鼠明显增加(P<0.01),且在MCD模型中的表达较HFD模型更明显(P<0.05);在同一模型中,LV-CREBH m1+m2+m3处理后,F4/80的表达较LV-NC明显上调(P<0.05),而LV-Gn T-V则显著改善了这种变化(P<0.05)。4.小鼠肝组织中CREBH、PPARα和SCD-1蛋白的表达Western blot结果显示:在两种NAFLD动物模型中,CREBH及PPARα蛋白表达减少(P<0.05),SCD-1蛋白表达增加(P<0.05);在相同模型小鼠中,LV-CREBH m1+m2+m3处理后,CREBH较正常组无明显减少(P<0.05),PPARα则较LV-NC减少的更加明显(P<0.01),SCD-1较LV-NC增加的更加明显(P<0.01);LV-Gn T-V处理后,高糖基化的CREBH的表达较LV-NC组增加(P<0.05),但仍少于LV-CREBH m1+m2+m3组(P<0.01),PPARα较LV-NC增加(P<0.05),SCD-1较LV-NC减少(P<0.05)。PPARα的变化在HFD模型中更加明显而SCD-1的变化则在MCD模型中更加明显。相似的结果在免疫荧光共聚焦实验中也得到验证。5.N-糖基化修饰CREBH对NAFLD相关因子的影响q RT-PCR结果显示:在两种动物模型肝组织中,CREBH m RNA的表达均比正常组降低(P<0.01),PPARαm RNA及FGF21 m RNA表达降低(P<0.05),SCD-1m RNA、Apo A-I m RNA和SREBP-1c m RNA的表达均升高(P<0.05);在LV-CREBH m1+m2+m3组中,这种变化显著高于LV-NC组(P<0.01),而LV-Gn T-V则明显改善这种变化(P<0.05)。同样,ALT、AST、TG和TC的水平以及TNF-α、IL-6和MDA的表达在LV-CREBH m1+m2+m3组中最高(P<0.01),SOD的表达最低(P<0.01),LV-Gn T-V能够缓解这种变化(P<0.05)。结论1.在两种NAFLD动物模型中,HFD模型与脂质代谢相关,MCD模型与脂毒性及炎症相关。2.CREBH非糖基化修饰可加重NAFLD肝脏病变,而高糖基化修饰的CREBH则可以逆转这种改变,发挥保护性作用。3.N-糖基化修饰CREBH可能通过调控PPARα和SCD-1的表达在脂质代谢、脂毒性、氧化应激及炎症反应方面影响NAFLD的发生发展。