第一章体外受精异常患者的临床相关研究第一节体外受精患者无可移植胚胎的原因分析研究目的:体外受精(in vitro fertilization,IVF)和/或卵子胞质内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)无可移植胚胎包括以下几种情况:卵母细胞激活失败、卵母细胞受精异常(即受精失败和多精受精)、受精卵分裂停滞和胚胎质量差。导致受精异常的因素多为卵子和/或精子的结构及功能紊乱。本章节拟对无可移植胚胎患者的临床资料进行回顾分析,以探究IVF和/或ICSI患者无可移植胚胎的发生原因及相关因素。研究方法:本研究纳入接受IVF和/或ICSI治疗的241例无可移植胚胎患者作为研究对象;选择同期就诊,首次行IVF和/或ICSI助孕鲜胚移植,并获得足月活产儿的1048例患者作为对照。收集患者数据,运用统计学方法比较无可移植胚胎组与对照组的一般资料和临床数据,并通过二元logistic回归分析可能对无可移植胚胎产生影响的相关因素。研究结果:我们发现体外受精无可移植胚胎的患者中包括完全受精失败、部分受精失败、受精卵非2PN受精、卵裂障碍及胚胎质量差的患者分别为33例(13.7%)、38 例(15.8%)、40 例(16.6%)、49 例(20.3%)和 81 例(33.6%)。无可移植胚胎组与对照组相比,夫妻双方一般情况、病史、临床特征、促排方案和助孕结局均有统计学差异。相比于对照组,无可移植胚胎组女方较为年轻(31.21±3.96 vs 32.1±4.28,P<0.05),无排卵/排卵障碍、子宫内膜异位症、复发性流产史/人工助孕失败史和不明原因所致不孕的患者比例高(9.54%vs 2.77%,P<0.05;4.98%vs 3.15%,P<0.05;12.97%vs 5.91,P<0.05;和 7.88%vs 1.81%,P<0.05),男方因素导致不孕的患者比例低(10.37%vs 30.06%,P<0.05),AFC较少[12(9-18)vs 14(11-18),P=0.004],但仍处于正常范围。与对照组相比,无可移植胚胎组采取的促排卵方案中长方案所占比例较低(41.91%vs 51.53%,P<0.05)、拮抗剂方案所占比例较高(28.22%vs 19.66%,P<0.05),且HCG日获得直径大于14mm的卵子数少[8(5-12)vs 10(7-12),P<0.05]。无可移植胚胎组的男方年龄略小(31.94±4.63 vs 32.95±5.23,P=0.033);精液指标好:精液浓度和前向运动精子百分率分别为4.65±1.58 vs 3.76±1.83(P<0.05)和[40(30-45)vs 10(1-37),P<0.05]。无可移植胚胎组获卵数、形成2PN受精卵数和卵裂数均明显少于对照组,分别为[8(4-13)vs 10(7-13),P<0.05]、[4(2-7)vs 7(5-10),P<0.05],和[2(1-5)vs 6(4-9),P<0.05]。而无可移植胚胎组的非2PN受精卵数多于对照组[1(0-3)vs 1(0-2),P<0.05]。通过二元Logistic回归,分析预测因素对无可移植胚胎的影响。经校正后,发现复发性流产史/人工助孕失败史(OR=3.007,95%confidence interval[CI]:1.406-3.606,P=0.007)、不明原因不孕史(OR=4.594,95%CI:1.566-13.478,P=0.005)、拮抗剂方案促排(OR=1.953,95%CI:1.038-3.675,P=0.083)和非 2PN 受精卵数(OR=1.300,95%CI:1.114-1.516,P=0.001)等因素与无可移植胚胎结局呈强正相关;卵裂数(OR=0.716,95%CI:0.599-0.857,P<0.001)和优胚数(OR=0.200,95%CI:0.154-0.26,P<0.001)与无可移植胚胎结局呈负相关。结论:本研究探讨了无可移植胚胎发生的原因及其相关因素,发现胚胎质量差者为无可移植胚胎结局的主要原因。有复发性流产史/人工助孕失败史和不明原因不孕史的患者、应用拮抗剂方案促排的患者,非2PN受精比例高的患者,及卵裂数和优胚数少的患者发生无可移植胚胎的风险增加。第二节IVF患者受精失败的原因及行补救性ICSI的妊娠结局分析研究目的:体外受精失败发生的主要原因可概括为以下两类:精子不能成功结合或注入卵母细胞;卵母细胞内部结构异常或激活异常而导致的受精停滞。而ICSI的原理是让精子绕过生物屏障机械穿透卵母细胞膜,因此对于受精失败患者可采取的补救方式首选ICSI。本节旨在探讨IVF受精失败患者的临床特征和发生原因,及补救性ICSI对其妊娠结局的改善情况。研究方法:本研究纳入844例IVF周期受精失败患者和13442例受精正常患者作为研究对象,回顾性分析两组的异同,并对行补救性ICSI后的妊娠结局指标进行统计分析。研究结果:与对照组相比,受精失败组的原发不孕患者、男方因素和不明原因所致不孕患者的比例较高,具有统计学差异(69.11%vs 49.00%,P<0.05;6.39%vs 2.63%,P<0.05;37.04%vs 27.37%,P<0.05)。受精失败组男方的前向运动精子百分率低于对照(37.42±15.80 vs 42.92±14.44,P<0.05)。对比两组的促排卵数据,我们发现受精失败患者的短方案应用比例低(17.28%vs 21.15%,P<0.05),HCG日子宫内膜偏厚(1.13±0.16 vs 1.10±0.20,P<0.05)。比较两组的实验室数据后发现,受精失败组获卵数、IVF所获2PN受精卵数和优胚数显著少于对照组,分别为[11(8-15)vs 12(8-16),P<0.05]、[0(0-1)vs 7(4-11),P<0.05]和[3(2-4)vs 4(2-6),P<0.05]。通过分析比较实施补救性ICSI后受精失败组与对照组的妊娠结局,发现二组的临床妊娠率、早期流产率和活产率均无显著性差异(53.15%vs 53.43%,P=0.931;14.07%vs 14.95%,P=0.778;48.26%vs 45.38%,P=0.452),但D3优胚率和着床率低于对照组(42.11%vs 55.29%,P<0.05;33.73%vs 38.73%,P<0.05)。结论:本研究结果提示原发性不孕、不明原因不孕、前向运动精子百分率低及促排卵后获卵数少可能导致体外受精失败的发生。补救性ICSI手段可有效挽救该类患者的助孕结局。第二章IVF受精失败和多精受精患者中的IZUMO1R基因突变筛查研究目的:第一章的研究提示少部分不孕患者在接受体外受精治疗时会出现异常受精的情况。既往研究发现与精子表面IZUMO1蛋白相结合的卵膜蛋白JUNO(IZUMO1R)参与了精卵识别及多精受精的膜关闭过程。因此,本研究对体外异常受精患者的IZUMO1R基因的全外显子进行测序,期望为临床诊疗提供参考。研究方法:本研究募集IVF治疗中发生完全/部分受精失败的患者215例,多精受精患者330例,和正常受精患者300例作为研究对象。提取其外周静脉血DNA,对IZUMO1R基因的外显子及其侧翼序列进行PCR扩增并测序,分析测序结果。研究结果:异常受精患者的IZUMO1R基因的测序结果显示:2例受精失败患者中发现位于第4外显子的非同义SNP rs76779571(c.510T T>G,p.His170Gln);3例多精受精患者中发现位于第1外显子的非同义SNP rs61742524(c.9C>G,p.Cys3Trp),位于启动子区域的同义 SNP rs76781645(c.-18G>T)和位于第2内含子的同义SNP rs377369966(c.329+8G>T)。其中错义突变c.510TT>G编码的氨基酸参与GPI锚定受体的构成,Polyphen-2软件预测结果显示,该突变可能具有致病风险。在多精受精患者中发现的非同义SNPc.9C>G(p.Cys3Tr),经预测可能无致病性。结论:本研究发现的IZUMO1R基因错义突变可能与受精失败和多精受精的发生相关。第三章WEE2基因突变在受精失败发病机制中的作用研究第一节反复体外受精失败患者中的WEE2基因突变筛查研究目的:5-10%的女性不孕是由遗传因素引起的,如染色体畸变、单/多基因突变和多态等。由WEE2基因编码的蛋白激酶WEE2又称WEE1B,隶属WEE激酶蛋白家族,参与调控卵母细胞从减数分裂转换为有丝分裂的进程,WEE2基因的纯合突变可能导致卵母细胞受精失败。因此,本研究对体外受精治疗中表现为反复体外受精失败的患者进行WEE2基因测序,期望为这些患者提供可能的分子遗传学诊断依据。研究方法:本研究纳入行体外受精治疗中反复出现异常受精的25例患者作为研究对象,提取其外周静脉血DNA,对WEE2基因的外显子及其侧翼序列进行测序分析。研究结果:分析25例反复受精失败者的测序结果发现,1例患者携带WEE2基因的复合杂合突变[c.416 C>T(p.Thr139Ile)和 c.585G>C(p.Lys195Asn)],1例患者携带WEE2基因的纯合突变[c.821G>A(p.Arg274His)]。以上3个变异位点在不同物种间高度保守,经疾病数据库预测3个变异点均具有致病性。结论:WEE2的纯合错义突变及复合杂合突变与反复体外受精失败有关,本研究扩展了WEE2基因的突变谱,为反复体外受精失败患者的临床诊疗提供了新的参考。第二节Wee2基因敲除小鼠的模型研究研究目的:Wee2基因参与哺乳动物卵母细胞的成熟及受精过程,是卵母细胞减数分裂成熟促进因子(maturation-promoting factor,MPF)和细胞静止因子(cytostatic factor,CSF)调控通路的重要分子。在我中心的前期研究中发现WEE2基因纯合及复合杂合突变与反复体外受精失败的发生有关,但携带该基因变异患者的卵母细胞减数分裂进程表型不一。小鼠的Wee2基因与人类该基因序列高度同源。因此,为进一步探究WEE2基因变异在体内的作用机制,我们构建Wee2基因敲除小鼠模型,探索Wee2基因敲除后小鼠的表型及其对卵母细胞发育和受精功能的影响。研究方法:本研究采用CRISPR/Cas9技术获得的C57BL/6品系Wee2基因敲除小鼠作为研究对象,鉴定其基因型,检测Wee2--雌鼠不同组织器官中Wee2基因mRNA水平的转录情况,观察杂Wee2+/-和We e2-/-雌鼠的生育力,并通过小鼠卵巢切片HE染色对比Wee2+/-和Wee2-/-雌鼠的卵巢及卵母细胞的形态。研究结果:本研究繁育出Wee2+/-和Wee2-/-小鼠,检测发现Wee2-/-雌性小鼠的Wee2基因的mRNA的表达明显降低。Wee2-/-雌鼠的生育力与Wee2+/-相比略有下降,但每窝产仔数和子代存活率无显著性差异。对8周龄Wee2+/-和Wee2-/-雌鼠的卵巢组织切片行HE染色,观察发现二者的卵巢及卵母细胞形态无明显差异。结论:研究结果提示Wee2基因敲除雌性小鼠的生育力及卵巢和卵母细胞形态无显著改变。