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随着经济的快速发展和人们生活水平的不断提高,化妆品安全问题受到越来越多人们的重视,微生物检验是化妆品质量控制的重要项目之一。天然植物性化妆品,近几年市场销售量很大,但我国对此类天然化妆品中微生物的研究甚少。本文以新疆产薰衣草精油,奥斯曼眼部用品,以及海娜粉系列染发产品为研究对象,通过薄膜过滤法排除防腐剂干扰,对16种天然植物性化妆品样品中的微生物进行分离筛选,微生物通过微孔滤膜过滤后富集,再将滤膜放置于培养基表面培养,根据滤膜上生长的菌落数量、菌落形态,进行分类初筛;对检出微生物进行革兰氏染色镜检,经过VITEK 2生化鉴定系统对分离出的菌株进行鉴定,采用美国Nccls颁布的标准方法对已鉴定致病菌做药物敏感试验;构建用于天然植物化妆品中典型致病菌的菌落PCR快速检测技术,并选取三株已鉴定的菌株,依据特异型基因,设计特异性引物,建立多重PCR快速检测体系,实现同时检测天然植物化妆品中三种致病菌的方法。试验结果可知16种样品通过运用滤膜法,对膏霜、乳剂,油状液体,固体粉状三类天然植物化妆品分别进行膜过滤前稀释,抑制防腐剂干扰试验,分离筛选出典型菌,结果较满意。在卵磷脂-吐温80上16种样品菌生长情况可知,膏霜、乳剂状样品和油状样品的最佳稀释比为10-3,即10mL供试液,进行薄膜过滤后再用含0.1%吐温80,0.9%生理盐水(45℃)冲洗薄膜3次,每次100ml;而固体粉状样品由于含菌量较大,稀释比例在10-4时,菌落生长数量可计且单菌落多,即10mL供试液,进行薄膜过滤后再用含0.1%吐温80,0.9%生理盐水(45℃)冲洗薄膜4次,每次100ml。通过验证实验,采用薄膜过滤法,接种7株代表菌的染菌回收率均高于90%,可见薄膜过滤法能有效去除防腐剂对含菌检出率的干扰。对检出100株微生物进行分离筛选,革兰氏染色镜检,经过VITEK 2生化鉴定系统鉴定得到37株致病菌:粪大肠杆菌5株,金黄色葡萄球菌1株,铜绿假单胞杆菌3株,肺炎克雷伯氏菌6株,地衣芽孢杆菌10株,阴沟肠杆菌10株,链球菌1株,肠球菌1株。6类抗生素药物与试剂药敏试验结果均得到显著抑菌直径环,且各菌株呈现不同程度的耐药性,无出现重大错误判定结果。针对分离出的地衣芽孢杆菌RpoB基因、肺炎克雷伯氏菌phoE基因、铜绿假单胞杆菌gyrA基因作为靶基因,设计3对特异性引物,所建立的三重PCR具有很高的敏感性和特异性,试验通过对退火温度、3对引物、Mg2+、EasyTaq DNA Polymerase等参数的优化,确定三重PCR的反应体系和反应程序。结果如下:10×Easy Taq Buffer(Mg2+)1.5μL,2.5 mM dNTPs 2.5μL,10μM gyrA上下游引物各1.0μL、10μMphoE上下游引物各1.0μL、10μM Rpo B上下游引物各0.5μL,模板DNA各2μL,5 U/μL EasyTaq DNA Polymerase 0.5μL,dd H2O补足25μL;反应程序为:94℃预变性3 min;按照94℃45 s,58℃45 s,72℃60 s进行30个循环;最后72℃延伸7 min。