研究背景与目的高脂血症是一种全身性疾病,指血中总胆固醇、甘油三酯过高和(或)高密度脂蛋白胆固醇过低,现代医学称之为血脂异常。随着我国经济水平的提高和人民生活质量的改善,高脂血症的发病率呈逐年上升趋势。有研究发现高脂血症与骨质疏松、牙周炎、种植体骨结合等骨再生相关疾病或过程有密切的联系,其中氧化修饰后脂蛋白,如,氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins,ox-LDL)逐渐引起各领域研究学者的重视。有研究证实,ox-LDL可以通过氧化应激、炎症反应、免疫调节等机制影响骨再生过程。前成骨细胞可以分化为成骨细胞,是骨再生的主要功能细胞,在骨再生过程中具有十分重要的作用。人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)是存在于牙周膜中的一种未分化的间充质干细胞,具有自我更新及多向分化潜能,可以维持牙周组织的稳态,参与牙周组织再生,因为其来源丰富、体外增殖能力和成骨分化能力强,成为口腔颌面部组织再生工程中重要的种子细胞之一。种子细胞微环境和细胞自身的活性状态是影响骨再生的重要因素,然而目前ox-LDL对MC3T3-E1细胞和hPDLSCs增殖和成骨分化的影响及机制仍不明确,因此本文拟通过探究ox-LDL对MC3T3-E1细胞和hPDLSCs增殖和成骨能力的影响,从而进一步揭示氧化修饰脂质对骨再生的影响,从而为高脂血症患者骨缺损疾病的治疗和骨组织再生提供理论支持。材料与方法1.培养MC3T3-E1细胞,进行MC3T3-E1细胞的传代与冻存、复苏;给予MC3T3-E1 细胞 0 u g/ml、5μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml ox-LDL刺激,处理1d、2d、3d、4d、5d,每天同一时间点通过CCK-8测定细胞的增殖活力;给予 MC3T3-E1 细胞含有 0 μ g/ml、5 μ g/ml、15 μ g/ml、30 μ g/ml、50μg/ml、100μg/mlox-LDL的成骨诱导液进行培养,于3d、7d、14d提取总RNA,通过实时定量反转录-聚合酶链式反应(quantitative real-time reverse transcription-polymer chain reaction,qRT-PCR)技术测定成骨相关基因(Collal,Alpl,Runx2)的表达水平,探究ox-LDL对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响;给予MC3T3-E1细胞含有0 μ g/ml、50μ g/ml ox-LDL的成骨诱导液进行培养,于7d、14d提取总蛋白,通过微量酶标法检测MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活力,探究ox-LDL对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。2.利用组织块贴壁法分离原代hPDLSCs;利用流式技术检测hPDLSCs表面标志;利用成骨、成脂诱导检验hPDLSCs多向分化潜能;进行hPDLSCs的传代与冻存、复苏。3.给予 hPDLSCs 0 μ g/ml、5 μ g/ml、15 μ g/ml、30 μ g/ml、100 μ g/ml ox-LDL刺激,处理1d、2d、3d、4d、5d,每天同一时间点通过CCK-8测定细胞的增殖活力;给予 hPDLSCs 含有 0μg/ml、5ug/ml、15μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml ox-LDL的成骨诱导液进行培养,于3d、7d、14d提取总RNA,通过qRT-PCR技术测定成骨相关基因(COL1A1,ALPL,RUNX2)的表达水平,探究ox-LDL对hPDLSCs成骨分化的影响;给予hPDLSCs含有0μ g/ml、50 μ g/ml ox-LDL的成骨诱导液进行培养,于7d、14d提取总蛋白,通过微量酶标法检测hPDLSCs碱性磷酸酶活力,探究ox-LDL对hPDLSCs成骨分化的影响。实验结果1.成功进行MC3T3-E1细胞的培养、传代、冻存与复苏。CCK-8结果显示,实验组OD值与空白组OD值没有明显差别。当MC3T3-E1细胞于含有50 μ g/ml、100 μ g/ml ox-LDL 的成骨诱导液培养3d后,成骨相关mRNA(Collal,Alpl,Runx2)明显下调;成骨诱导7d后,15μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml组成骨相关mRNA(Collal,Alpl,Runx2)均出现明显下调;成骨诱导14d后,15μg/ml、30μg/ml组成骨抑制作用不再明显,但是50μg/ml、l00μg/ml组的成骨相关mRNA(Collal,Alpl,Runx2)依旧呈现明显下调趋势,差异具有统计学意义。当MC3T3-E1细胞于含有50 μ g/ml ox-LDL的成骨诱导液培养14d后,碱性磷酸酶活力明显下降,差异具有统计学意义。2.成功分离培养原代hPDLSCs,高表达间充质干细胞表面特异标记,并可以实现成骨、成脂分化;成功进行人牙周膜干细胞的传代培养与冻存、复苏。3.CCK-8结果显示,第3d时hPDLSCs ox-LDL刺激组OD值略大于空白组OD值,且持续至第5d,差异具有统计学意义。COL1A1mRNA在hPDLSCs所有实验组中3d、7d、14d均出现明显下降,其中14d时下降程度最为明显。ALPL、RUNX2 mRNA 在 hPDLSCs 细胞 50 μ g/ml、100 μ g/ml ox-LDL 成骨诱导组培养3d、7d后出现不同程度的下调,在成骨诱导14d后,在所有实验组均出现明显下调。当hPDLSCs于含有50 μ g/ml ox-LDL的成骨诱导液培养7d和14d后,碱性磷酸酶活力均出现明显下降,差异具有统计学意义。实验结论与意义100μ g/ml浓度以内的ox-LDL对MC3T3-E1细胞的增殖没有明显影响,50μ g/ml浓度及以上的ox-LDL抑制MC3T3-E1细胞Collal,Alpl,Runx2成骨相关mRNA的表达,抑制碱性磷酸酶活性,抑制其成骨分化潜力;5 μg/ml浓度及以上的ox-LDL轻度促进hPDLSCs的增殖,但促进作用并不显著。50μg/ml浓度及以上的ox-LDL抑制hPDLSCs细胞COL1A1,ALPL,RUNX2成骨相关mRNA的表达,抑制碱性磷酸酶活性,抑制其成骨分化潜力。上述结论证实一定浓度的ox-LDL可以抑制前成骨细胞及牙周膜干细胞的成骨分化能力,从细胞水平证实了氧化修饰脂质对骨再生的负面影响,从而为高脂血症患者骨缺损疾病的治疗和骨组织再生提供理论支持,为骨组织再生微环境的控制提供一定的参考意义。