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研究目的三阴性乳腺癌（TNBC）指癌组织中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和表皮生长因子受体2（HER-2）均为阴性的乳腺癌。由于TNBC对以ER、PR为靶点的内分泌治疗和以HER-2为靶点的靶向药物治疗均无效,使其临床治疗面临重大挑战。因此,寻找新的有前景的抗三阴性乳腺癌药物迫在眉睫。多项研究证明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有抗肿瘤作用。本研究旨在探究新型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,2-己基-4-戊炔酸（HPTA）,对化疗药物羟基脲（HU）的敏感性的影响,以及HPTA对HU敏感性的影响是否与复制蛋白A磷酸化（RPA2-p）介导的HR修复功能和ATR-CHK1介导的细胞周期调控通路受损相关。研究方法1.所选细胞系及各组药物处理实验选用两种人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468,MDA-MB-231,主要分为四个处理组,分别为:对照组、HPTA组（15μMHPTA单独处理24h）、HU组（2mM HU单独处理18h）以及HU+HPTA组（15μM HPTA预处理24h后联合 2mM HU 处理 18h）。2.细胞克隆形成实验检测HPTA对三阴性乳腺癌细胞存活的影响利用克隆实验比较药物处理后人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231后细胞的生长增殖情况,计算各处理组克隆形成率进行细胞存活的比较分析。3.细胞核DNA双链断裂损伤的检测中性、碱性彗星实验检测:比较各处理组细胞拖尾程度,并对细胞拖尾程度进行定量分析以检测细胞核内DNA的双链断裂损伤（DSBs）。免疫荧光与免疫印迹实验检测:药物处理结束后,用免疫荧光和免疫印迹实验分别检测每组细胞的DNADSBs标志物γH2AX,、53BP1焦点形成和蛋白表达情况。4.细胞合成致死实验检测HPTA对细胞同源重组修复效率的影响基于细胞合成致死理论推测如果HPTA能够干扰HR修复通路,那么HPTA与PARPis联合将会导致TNBC细胞死亡。分别检测HPTA单独作用、细胞聚合酶抑制剂ABT888单独作用、HPTA联合ABT888作用后细胞的生长存活情况,计算各处理组细胞克隆形成率,间接分析比较不同组间HR效率。5.磷酸化复制蛋白A2（RPA2-p）和重组酶（Rad51）表达的检测RPA2-p特异地参与HU诱导的DSBs的HR修复通路;且该通路是Rad51依赖的,RPA2-p能募集Rad51,对基因组稳定性起重要作用。因此,我们检测TNBC细胞的RPA2-p和Rad51的表达水平以研究HPTA对HR分子机制的影响。通过免疫印迹实验检测各组细胞中RPA2-p和Rad51蛋白水平;通过免疫荧光染色,检测各处理组RPA2-p和Rad51焦点形成水平。6.流式细胞术及免疫印迹实验测HPTA对细胞周期的影响S/G2期是HR修复的活跃期,通过检测HPTA能否对细胞周期产生影响,以探究HPTA对细胞HR机制的影响是否与细胞周期调控有关。通过流式细胞术检测S期BrdU的掺入量,比较各处理组细胞的周期进程。免疫印迹实验检测S期细胞周期调控通路相关蛋白ATR和CHK1-p的表达。7.统计分析Student’s t检验用于两组间比较,单因素方差分析用于多组比较。P<0.05时认为差异显著。数据采用SPSS（23.0）软件分析。研究结果1.低剂量HPTA可增加三阴性乳腺癌细胞对HU的敏感性克隆实验结果表明,HPTA联合HU能明显抑制MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞生长增殖,其抑制作用显著强于HU单独处理组。HPTA与HU联合对TNBC细胞具有协同杀伤作用。2.低剂量HPTA增加HU诱导的三阴性乳腺癌细胞内DNA DSBs蓄积中性、碱性彗星实验结果显示,单独HPTA作用组的彗星尾距与空白对照组比有轻度增加,HU单独处理使彗星尾距显著增加,HPTA与HU联合作用组细胞尾距增加最为明显。HU处理导致MDA-MB-468、MDA-MB-231 DNA复制叉阻滞,进而发展为DSBs,而HPTA与之联合使彗星尾距增长,则低浓度HPTA可使HU诱导的DNA DSBs蓄积。免疫印迹结果显示,联合组TNBC细胞中DNA DSBs标志物γ-H2AX、53BP1蛋白表达水平与HU单独作用组相比明显升高。免疫荧光实验显示,联合组γ-H2AX、53BP1焦点形成水平显著升高。3.低剂量HPTA抑制三阴性乳腺癌细胞的HR修复活性细胞合成致死实验发现,与对照组相比,HPTA单独处理使细胞存活率略有下降;ABT888单独处理,细胞存活率一定程度降低;HPTA与ABT888联合处理,细胞存活率进一步显著降低。即HPTA与PARPis联合对TNBC细胞产生合成致死效应,因此我们认为低剂量的HPTA可抑制TNBC细胞的HR修复活性。4.在HU诱导的DNA复制损伤中,HPTA抑制RPA2-p介导的HR修复效率免疫印迹实验检测各处理组细胞RPA2-p的表达,HU诱导TNBC细胞RPA2-p表达升高。HPTA与HU联合,RPA2-p的表达被抑制。免疫荧光实验的结果也能得到一直结论。对Rad51蛋白进行相应的检测,结果显示,单独HU作用组,Rad51焦点形成水平明显升高。联合组与单独HU组比,Rad51焦点形成水平降低。因此该结果提示低剂量HPTA可以抑制Rad51的功能。5.低剂量HPTA能抑制HU诱导的细胞在S期的阻滞HPTA单独作用对细胞周期产生较小影响,处在S期的细胞比例略有上升。HU单独作用使大量细胞阻滞在S期,而HPTA预处理之后,HU诱导的蓄积在S期的细胞比例显著降低。免疫印迹实验检测细胞周期调控相关蛋白ATR、CHK1。HU单独作用使ATR、CHK1-p（s345）、CHK1-p（s317）蛋白表达增加,而 HPTA 预处理后 ATR、CHK1-p（s345）、CHK1-p（s317）蛋白表达显著降低。研究结论1.通过两种人三阴性乳腺癌细胞系,发现低剂量HPTA能够增加HU诱导的细胞核内DNA DSBs蓄积,增强三阴性乳腺癌细胞对HU的敏感性。2.低剂量HPTA对HU的增敏作用可能与抑制RPA2-p/Rad51介导的HR修复通路和抑制ATR-CHK1介导的细胞周期调控通路有关。