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第一部分CRISPR/Cas9系统对HPV18 E6、E7表达的影响目的:利用CRISPR/Cas9系统设计的一段特异性sg RNA序列定点敲除HPV18病毒的致癌基因E6、E7,研究其对宫颈癌Hela细胞中致癌基因表达的影响。方法:利用CRIPSR/Cas9系统构建分别针对HPV18型DNA致癌基因E6、E7的三组靶向Cas9-sg RNAs序列,基于此质粒包装产生慢病毒,将其转染宫颈癌Hela细胞系,RT-PCR检测不同类型的sg RNA序列对于细胞致癌基因E6或E7m RNA转录水平影响,Western Blot检测不同类型的sg RNA序列对细胞关键致癌基因E6或E7蛋白表达水平影响。结果:将靶向HPV18E6、E7基因的Cas9-sg RNA载体分别转染至Hela细胞48h后,RT-PCR结果显示,与对照组相比,E6 sg RNAs组E6m RNA表达抑制率分别为28%、85%、19%,E7 sg RNAs组E7m RNA表达抑制率分别为86%、25%、27%,差别均具有统计学意义(P<0.05),且E6-sg RNA2及E7-sg RNA1两组的抑制效果最明显;Western Blot结果表明,与CT组相比较,E6 sg RNAs组的蛋白表达量均有所减少,且E6-sg RNA2组更为明显,而E7-sg RNA1组蛋白表达量较其他三组明显减少,与PCR结果相一致。结论:应用CRISPR/Cas9系统阻断HPV18E6或E7基因后,Hela细胞中致癌基因E6或E7m RNA转录水平及蛋白表达水平降低。第二部分CRISPR/Cas9系统对Hela细胞生存能力的影响目的:进一步探讨两组有效序列对宫颈癌Hela细胞的细胞周期及独立生存能力的影响。方法:通过上述实验获得两组对于致癌基因的表达抑制最显著的序列,即E6-sg RNA2序列组和E7-sg RNA1序列组,将其转染宫颈癌Hela细胞系,PI染色流式细胞仪检测不同类型的质粒对宫颈癌Hela细胞的周期阻滞的影响;平板细胞克隆形成实验反映不同类型的质粒对于Hela细胞的群体依赖性和增殖能力的影响。结果:将E6-sg RNA2序列组和E7-sg RNA1序列组载体分别转染至宫颈癌Hela细胞后,流式细胞仪周期分析结果显示,E6组处于G1/G0期细胞数量增加了14.2%,E7组处于G1/G0期细胞数量增加了7.1%,两组均表现出明显的细胞周期阻滞;细胞平板克隆形成实验结果表明,转染E6及E7sg RNA质粒后,两实验组的Hela细胞集落数较对照组明显减少,克隆形成能力明显减弱。结论:CRISPR/Cas9系统阻断HPV18E6或E7基因可对Hela细胞产生周期阻滞作用,且Hela细胞的群体依赖性和细胞增殖能力亦有影响。