冬眠是某些动物为适应冬季寒冷缺食的恶劣环境而进化产生的一种重要的动物学现象。其中,冬眠哺乳动物的心血管系统适应冬眠和激醒过程的特殊生理条件形成显著的机能稳定性。除了具有耐低温、抗心律失常、耐缺氧等特点外,冬眠动物心脏的收缩功能在冬眠状态下显著增强,进而提高心脏的泵血能力,使得血液供应在冬眠状态心率慢、血液黏度高等不利情况下也能满足机体正常的生理需求,这正好与心力衰竭疾病心脏收缩力不足的情况相反。因此,全面阐明冬眠状态心脏收缩力增强的内在机制,将为心力衰竭的治疗提供新的医学思路。　　心脏的收缩功能主要由心肌细胞的兴奋收缩耦联过程介导的,即在动作电位的驱动下,细胞膜上的电压门控L型钙通道(L-type Ca2+channel, LCC)开放,以钙致钙释放的方式触发肌质网上的钙释放通道 Ryanodine受体(Ryanodine receptor, RyR)产生钙瞬变,进而引起细胞收缩的过程。为了阐明心肌细胞兴奋收缩耦联过程在冬眠状态中的变化,我们采用全细胞膜片钳结合激光共激焦钙成像技术同步记录冬眠动物达乌尔黄鼠心肌细胞的L型钙电流和全细胞钙瞬变,以测量兴奋收缩耦联的效率。我们发现,冬眠状态下 L型钙电流密度显著下降,但其触发的钙瞬变幅度并没有发生变化,表明心肌细胞的兴奋收缩耦联效率显著提高;而且,冬眠状态下肌丝对Ca2+的敏感性增加,从而增强心肌细胞的收缩力。心肌细胞中单个LCC介导的钙内流触发RyR开放产生的钙火花是全细胞钙瞬变的基本单元。为了探索冬眠状态兴奋收缩耦联效率提高的内在机制,我们利用独特的松钳技术结合钙成像方法观测单个LCC与RyR的分子耦联过程,通过测量LCC触发RyR开放的延迟时间及其成功率来反映LCC与RyR分子间的耦联效率。我们发现,LCC触发RyR开放的延迟时间在冬眠状态中显著缩短,进而提高LCC触发RyR开放的成功率,这表明LCC与RyR分子间的耦联效率在冬眠状态下显著增强。另外,钙火花的幅度显著上升,表明冬眠状态下动员了 RyR簇中更多的通道参与钙释放活动。进一步的钙尖刺记录实验表明,冬眠状态LCC与 RyR分子间耦联效率的提高促使钙致钙释放过程趋向同步化,进而增强全细胞兴奋收缩耦联的效率。以上结果证明,LCC与RyR分子间耦联效率的提高是冬眠状态心脏收缩力增强的内在机制。　　为了进一步探索LCC与RyR分子间耦联效率提高的结构与分子机制,我们采用电子显微镜技术检测心肌细胞横管与肌质网耦联结构的变化。我们发现,冬眠状态下横管与肌质网耦联结构的数目显著增多、耦联长度显著增加,使得心肌细胞钙释放位点的数目增多、面积增大。更重要的是,横管与肌质网间的耦联距离显著缩短,使LCC与RyR之间的距离缩短了约40％,从而加快RyR对LCC的响应速度。通过对耦联结构相关蛋白表达量的筛查发现,横管与肌质网耦联结构维持的关键蛋白Junctophilin2(JP2)及其膜相互作用蛋白Caveolin3表达量在冬眠状态中显著上调,这是引起横管与肌质网耦联结构重塑的主要原因。这些冬眠过程中心肌细胞功能重塑的结构与分子机制与心力衰竭过程正好相反。基于以上的发现,我们首次提出冬眠是“反心衰”的天然模型。　　越来越多的研究表明,JP2在维持横管与肌质网耦联结构和兴奋收缩耦联功能中起关键作用。那么,探索JP2在心肌细胞中的上游表达调控机制就显得尤其重要。为了解决这个问题,我们首先利用生物信息学方法来预测JP2 mRNA3非编码区(untranslated region, UTR)上潜在的miRNA调控位点。我们发现,进化上非常保守的miR-24在人、大鼠、小鼠等物种的JP2 mRNA3UTR上都存在着两个潜在的结合位点。对其表达量进行分析后发现,miR-24在冬眠过程中下调了40%,而在心力衰竭病人中上调了约200%,与JP2表达量的变化正好相反。进一步的荧光素酶报告实验证实miR-24可以结合到JP2 mRNA3UTR上并参与对JP2的表达调控。为了探索 miR-24对心肌细胞结构和功能的影响,我们采用腺病毒表达系统在培养的成年大鼠心肌细胞中过表达miR-24。结果显示,当miR-24表达上调约150%时,内源 JP2 mRNA和蛋白水平的表达量分别下调了58%和46%。通过结构和功能的检测发现,过表达 miR-24后横管与肌质网耦联结构的数目显著减少、耦联的长度显著缩短,进而引起心肌细胞钙致钙释放过程出现不均一性和去同步化,最终削弱心肌细胞的兴奋收缩耦联功能。过表达miR-24后心肌细胞结构和功能的重塑过程重复了心力衰竭和直接敲减JP2类似的结果。以上结果强烈提示我们,在心力衰竭病理情况下miR-24的上调主要是通过下调JP2的表达来实现对心脏结构和功能的负调控,揭示心力衰竭病理过程的关键调控机制。　　为了进一步探索在心力衰竭发展过程中抑制 miR-24的上调是否可以阻止JP2表达的下调,进而阻止心力衰竭的发生。我们采用主动脉结扎的小鼠模型,通过尾静脉注射特异针对miR-24的antagomir来干扰miR-24表达的上调,并通过超声心动定期检测心脏整体功能的变化。我们发现,antagomir能够有效地抑制主动脉结扎小鼠心肌细胞miR-24表达的上调和JP2表达的下调,从而阻止心脏整体收缩功能的下降。在单细胞水平上表现为,antagomir可以有效地维持心肌细胞横管与肌质网的耦联结构以及兴奋收缩耦联的功能。以上结果表明,在体抑制miR-24表达的上调能够有效地阻止主动脉结扎小鼠心脏功能向去代偿阶段的转变。这样,miR-24就可以为心力衰竭的治疗提供一个潜在的药物靶点。　　综上所述,本文的研究第一次全面阐明冬眠动物心脏的收缩力在冬眠状态中增强的结构与分子机制,证明冬眠状态中JP2和Caveolin3蛋白表达的上调是引起横管与肌质网耦联结构的重塑,从而提高心肌细胞兴奋收缩耦联功能的主要原因。在此基础上,我们进一步揭示了miR-24参与JP2的上游表达调控,并且抑制miR-24的表达上调能够阻止心脏功能向去代偿阶段的转变。这一新发现有助于我们了解心力衰竭的发病机理,为心力衰竭的治疗提供重要的参考依据。