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目的:PAC1-R作为B类G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR),主要介导了神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)的神经保护作用,是神经系统疾病药物开发的重要靶点。但是目前针对PAC1-R受体的药物多是多肽类药物,存在效应时间短等问题,因而利用化学小分子别构调节剂调控PAC1-R的活性被认为是一种新型的有效治疗相关疾病的方案。本研究在强力霉素(doxycycline,DOX)靶向PAC1-R的N端胞外域别构调节位点并作为PAC1-R正向别构调节剂(positive allosteric modulator,PAM)研究的基础上,通过计算机虚拟筛选出能与PAC1-R的正向别构调节位点结合的系列化合物,并对虚拟筛选得到的化合物进行分子水平和细胞水平的检测、分析与鉴定,从而建立一套预测、筛选和鉴定PAC1-R别构调节剂的技术和方案。方法:首先使用1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP~+)诱导人神经母细胞瘤细胞SHSY-5Y凋亡从而建立帕金森症细胞模型,并对该模型是否可以作为正向小分子别构调节剂的筛选工具进行检测;其次模拟DOX结合PAC1-R的N端胞外域别构调节位点,应用虚拟对接程序对小分子库的化合物进行靶向PAC1-R的N端胞外域别构调节位点的虚拟筛选,得到一系列的候选正向小分子别构调节剂;而后通过微量热电泳(Microscale Thermophoresis,MST)检测候选正向小分子别构调节剂与PAC1-R的N端胞外域结合的亲和力,以及利用帕金森症细胞模型检测候选正向小分子别构调节剂通过PAC1-R介导的抗细胞凋亡活性,筛选得到活性最优的正向小分子别构调节剂;最后针对筛选获得的最优正向小分子别构调节剂,利用人为高表达PAC1-R的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)PAC1-CHO细胞结合cAMP检测测定其作为PAC1-R的PAM协同促进PAC1-R天然配体PACAP27激活效率的活性;并利用帕金森症细胞模型从细胞水平确定该最优正向小分子别构调节剂对PAC1-R的神经保护作用。结果:1)MPP~+(8mM)有效诱导SHSY-5Y细胞凋亡及多巴胺和多巴胺转运蛋白的降低,建立了MPP~+诱导的SHSY-5Y帕金森症细胞模型;2)DOX与米诺环素能够通过PAC1-R有效抵抗MPP~+诱导的SHSY-5Y细胞凋亡,表明MPP~+诱导的SHSY-5Y帕金森症细胞模型可用于PAC1-R正向小分子别构调节剂的筛选;3)对系列虚拟筛选获得的靶向PAC1-R的N端胞外域的正向小分子别构调节剂进行MST测定和MPP~+诱导的SHSY-5Y帕金森症细胞模型筛选,得到一个与PAC1-R的N端胞外域亲和力最强且能有效保护SHSY-5Y细胞的正向小分子别构调节剂,命名为SPAM1(Small molecular positive allosteric modulator 1);4)利用PAC1-CHO细胞结合cAMP检测测定对于0.1nM PACAP27,DOX作为PAM的EC50为0.81±0.18μM,SPAM1作为PAM的EC50为0.59±0.14μM;并且在1μM SPAM1/DOX的存在下,PACAP27的剂量-效应关系曲线明显左移,且SPAM1的作用效果略优于DOX,说明了SPAM1是PAC1-R的新型PAM;5)利用MPP~+诱导的SHSY-5Y帕金森症细胞模型确证SPAM1对PAC1-R的别构调节作用及其细胞水平的神经保护作用。结论:本研究首次尝试开展靶向PAC1-R N端胞外域中的别构调节位点的新型正向小分子别构调节剂的虚拟筛选;其次在分子和细胞水平上对虚拟筛选得到的正向小分子别构调节剂进行实验室验证,从而得到靶向PAC1-R的别构调节活性最佳的正向小分子别构调节剂(SPAM1);最后测定了该正向小分子别构调节剂的正向别构调节效果以及神经保护作用;从而初步建立了一套有效筛选与检测PAC1-R的别构调节剂的技术方法与实验方案,为更多靶向PAC1-R的别构调节剂的发现和创制打下基础。