猪链球菌病(Streptococcus suis S.Suis)是因为猪链球菌感染而导致的分布极其广泛的传染病,对养殖业和人类影响极大。该病含有35个血清型,其中2型(S.Suis 2)发病率最高,主要以淋巴结炎、关节炎、脑膜炎及败血症为主要临床特征,已被国家规定为二类动物疫病。然而在近期的临床实践中发现部分西藏林芝地区的藏猪出现类似于S.Suis的临床症状,故此拟通过血清学调查进一步掌握该病在林芝地区藏猪的流行情况,以期为后续的防疫工作和综合性措施提供依据。肠球菌(Enterococci)存在广泛,为条件性致病菌。然而近年不科学的抗生素应用使肠球菌耐药越发严重,不仅对高水平氨基糖苷类药物耐药,对大环内酯类、β-内酰胺类、四环素类及糖肽类抗生素等的耐药率也较高,肠球菌引起的各种传染病也随之增多。然而,要想研究其耐药性,分离肠球菌是必不可少的一步,而肠球菌又与其他球菌表型相似,故很难区分,加之其分布随地区的不同而不同,西藏林芝地区对此研究甚少,故本研究就肠球菌的分离鉴定及其耐药问题展开研究。本研究分别对2014年12月份到2015年1月份间在西藏林芝地区所分离的438份血清进行ELISA试验,完成对猪链球菌2型在该地区阳性率的初步调查,这对增强当地居民对猪链球菌病的防控意识,具有重要的公共卫生学意义。同时,本研究对2015年7月到9月份及2016年6月到8月期间所采取的藏猪内脏及粪便进行肠球菌分离,并对分离菌株进行耐药及MIC试验。以此为基础,筛选出耐药性肠球菌菌株并进行基因检测。试验结果与结论如下:1.猪链球菌的检测结果本试验采用双抗原夹心酶联免疫法(ELISA)对林芝县及米林县共438份血清进行检测。检测结果显示:所有血清的抗体阳性率为60.05%(263/438)。其中,雌性、雄性分别为61.50%和58.96%,林芝县与米林县的阳性率分别为61.79%和57.81%。应用SPSS 13.0软件统计分析得出,在本研究中,性别及两地区间无显著性差异(P≥0.05)。本研究说明林芝地区藏猪S.Suis 2隐性感染率较高,当地居民应加强该病的防控意识。2.藏猪源肠球菌的分离情况本研究采用胰酶大豆琼脂(Tryptic Soy Ager,TSA)固体培养基(加入2%兔血清,50μg/ml氨曲南及10μg/ml多粘菌素B)用于选择性分离培养肠球菌,进而通过触酶试验并结合生化特征初步鉴定为肠球菌,最后进一步结合16SrDNA以及肠球菌特保守的tuf基因通过pcr进一步验证得出如下结果:2015年从105个样品中共分离出51株、4种藏猪源肠球菌(48.6%):E.faecalis 15株(29.4%),E.faecium 4株(7.8%),E.hirae 27株(52.9%),E.durans 2株(3.9%)及其他肠球菌3株(5.9%),E.durans为首次在藏源猪获得;2016年从120个样品中共分离出45株、2种藏猪源肠球菌(37.5%):E.faecalis 12株(26.7%),E.faecium 6株(13.3%)及其他肠球菌27株(60%)。3.肠球菌耐药检测情况本研究通过采用K-B药敏片法及MIC法对2015-2016年两年分离菌株进行6类10种抗菌药物的敏感性测定。结果显示:所有肠球菌对卡那霉素、庆大霉素及链霉素高水平耐药率高达60%到80%以上,而对万古霉素的敏感率均为100%,红霉素及四环素的耐药率均接近50%。2016年与2015年相比,氨苄西林的耐药率明显增加。头孢呋辛、青霉素及左氧氟沙星的耐药率均为10%左右,敏感率较高,且两年增减幅度不大。此外,两年份的菌株均表现为严重的多重耐药性,尤其为粪肠球菌,高达5耐,未发现6耐菌株。说明当地居民以后应多加注意并科学用药。4.肠球菌耐药基因的检测与分析结合K-B药敏片法及MIC的结果,本研究分别对两年份5类药物10种耐药基因(aac(6’)-Ie-aph(2’)-Ia,aph(3’)-IIIa,aph(2’)-Ic,ant(4’)-Ia,ant(6’)-Ia,ant(3’)-(9),TEM,ermB,mef A,tetM)进行检测,结果发现:菌株的耐药表型及耐药基因之间并不呈正相关。比如2015年耐高水平链霉素菌株为31株,但并无携带ant(6’)-Ia和ant(3’)-(9)的肠球菌。2015年部分菌株携带aac(6’)-Ie-aph(2’)-Ia,ant(4’)-Ia,ermB及tetM的阳性率高达100%,没有发现aph(3’)-IIIa,aph(2’)-Ic,ant(6’)-Ia,ant(3’)-(9)及mef A耐药菌株,但2016年分离的肠球菌中发现有6株携带aph(3’)-IIIa,3株携带ant(6’)-Ia,但没有检测到ant(4’)-Ia,其余分离率与2015年相比有微增长现象。虽然分离率不高,但E.faecalis与E.faecium均比其他肠球菌的分离率高。该结果说明E.faecalis与E.faecium的耐药性比较严重,且2016年与2015年相比并没有下降趋势。