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研究背景蛋白转导技术是指利用蛋白转导作用域将与之共价结合的化合物、肽、反义肽核酸或与之融合表达的全长蛋白质通过非受体依赖、非转运蛋白依赖方式运送至细胞内的一种技术。蛋白转导作用不是通过全长蛋白发生的，而是依赖于长约10～16个氨基酸残基的富含碱性氨基酸残基的在生理pH值条件下带净正电荷的氨基酸序列，该序列即被称为蛋白转导作用域。最近研究表明蛋白转导技术不仅可显著提高药物进入细胞的效率，而且可作为肿瘤基因治疗的辅助手段来提高对肿瘤组织的杀伤效率，更被用来引导特定抗原进入MHCⅠ类分子依赖的抗原提呈途径并能显著增强肿瘤多肽疫苗和基因疫苗的免疫效能，然而目前尚无研究阐明蛋白转导功能域的转导能力与其对基因疫苗免疫效能的增强能力之间的相互关系。
目的自行设计并制备重组腺病毒介导的、针对hTERTI540表位的基因疫苗并对其体外加载树突状细胞后诱发抗肿瘤免疫的能力进行评价，比较具有不同蛋白转导能力的蛋白转导功能域对诱发抗肿瘤免疫力的影响。
方法和结果1、根据hTERTI540表位、HIV-1TAT-PTD和人工合成的PTD4的氨基酸序列，设计I540-PTD和I540-PTD4并根据人类偏爱密码子反翻译(back-translation)为基因序列，掺入kozak序列，获得真核表达读框。设计6条寡聚脱氧核糖核苷酸链，经磷酸化、退火并连接后克隆至pSP72载体，获得pSP72-I540-PTD和pSP72-I540-PTD4。双酶切鉴定和DNA测序均证实成功获得I540-PTD和I540-PTD4真核表达读框。
2、将I540-PTD和I540-PTD4真核表达读框亚克隆至穿梭质粒pDC315，经双酶切鉴定获得pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4。将pDC315-I540-PTD和pDC315-I540-PTD4与主干质粒pBHGloxdeltaE13Cre共转染HEK293细胞，10天后可见典型的细胞病变反应，收获细胞，制备病毒粗提液，经扩增和纯化获得重组复制缺陷型腺病毒Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4。使用终点稀释实验和空斑形成实验测定纯化后病毒滴度。Ad-I540-PTD的滴度分别为8.9×109pfu/ml和6.3×109pfu/ml，Ad-I540-PTD4的滴度分别为5.8×109pfu/ml和5.4×10pfu/ml9。自行设计引物，对Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4进行PCR鉴定，成功获得167bp目标片断。使用抗组胺酸标签抗体进行免疫组化分析发现经Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4转染的U2OS细胞均呈强染，证实Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4中携带的I540-PTD和I540-PTD4真核表达读框可在人类细胞内表达。
3、使用HLA-A*0201+人外周血分离纯化单个核细胞，经GM-CSF和IL-4作用下分化为树突状细胞，经TNF-α诱导后光镜和电镜观察均可见典型成熟树突状细胞形态。
4、使用MTT法测定PBMC、树突状细胞(DC)、经Ad-I540-PTD转染的树突状细胞(PTD-DC)和经Ad-I540-PTD4转染的树突状细胞(PTD4-DC)刺激自体T淋巴细胞增殖的能力发现PBMC和未转染DC对自体T细胞均有低水平的增殖刺激能力，而PTD-DC组和PTD4-DC组在各浓度的刺激指数均显著高于PBMC组和DC组(t检验，P＜0.01)，在树突状细胞和T细胞比为1：10时可分别达到11.75±0.26和12.17±0.46。同时PTD-DC组和PTD4-DC组在各浓度的SI相比没有显著差异(t检验，P＞0.05)。
5、分别使用hTERT+HLA-A*0201+的MCF-7细胞和hTERT-HLA-A*0201-的U2OS细胞作为刺激细胞，用ELISA法测定效靶比为50：1时山PBMC、DC、PTD-DC和PTD4-DC致敏的T淋巴细胞释放TNF-α能力。经致敏的CTL在没有刺激细胞存在时仅有低水平的TNF-α释放，而当使用MCF-7和U2OS作为刺激细胞时释放的TNF-α水平显著增高，以PTD-DC和PTD4-DC致敏的T淋巴细胞组(PTD-DC-L组和PTD4-DC-L组)更为显著(t检验，P＜0.01)。然而在PTD-DC-L组和PTD4-DC-L组使用U2OS刺激TNF-α释放浓度分别为35.6±2.9pg/ml和31.9±3.1pg/ml，显著低于使用MCF-7时的80.9±3.8pg/ml和84.3±3.5pg/ml(t检验，P＜0.01)。
6、以hTERT+HLA-A*0201+的MCF-7作为靶细胞，测定不同效靶比时各组的特异性杀伤效应。与PBMC-L组和DC-L组相比，PTD-DC-L组和PTD4-DC-L组对MCF-7有较强的杀伤作用(t检验，P＜0.01)，杀伤效应随效靶比升高而增强，当效靶比为100：1时特异性杀伤率可分别达到75.7±4.1％和79.3±3.7％。然而PTD-DC-L组和PTD4-DC-L组对MCF-7的杀伤能力在各效靶比时均没有显著差异(t检验，P＞0.05)。
结论1、设计并构建了携带I540-PTD和I540-PTD4融合基因表达框的复制缺陷型重组腺病毒Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4。
2、Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4体外转染树突状细胞后可诱发高水平的hTERT特异性抗肿瘤免疫，提示HIV-1TAT-PTD和PTD4均可用于制备高效肿瘤基因疫苗。同时Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4可以exvivo方式广泛用于为HLA-A*0201+hTERT+恶性肿瘤患者的免疫治疗。
3、尽管PTD4的蛋白转导活性较HIV-1TAT-PTD高约30倍，然而Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4体外转染树突状细胞后诱发hTERT特异性抗肿瘤免疫的能力没有显著差异，提示蛋白转导功能域的活性强弱与融合基因疫苗所激发的抗肿瘤免疫力无相关性。