大菱鲆(Scophthalmus maximus)是原产欧洲沿海的一种名贵低温经济鱼类。黄海水产研究所于1992年“跨洋引种”将其引入我国,目前已成为我国北方沿海工厂化养殖业的主导品种之一。近年来,随着我国消费市场需求的增长和环保政策的引导,我国北方适合大菱鲆养殖的水资源和养殖区域不断减少。为满足消费需求,大菱鲆养殖面积逐渐向滩涂和内陆地区扩展。因此,养殖水体的盐度逐渐成为影响大菱鲆养殖的重要因素。为加快大菱鲆耐低盐新品种的育种进程,解析大菱鲆应答低盐胁迫的分子机制,本文对大菱鲆肝脏代谢酶和渗透调节基因在低盐胁迫下的变化进行了研究和分析。以期对低盐环境下大菱鲆的养殖及培育耐低盐环境的大菱鲆良种提供理论参考。1.盐度是水产养殖环境胁迫的重要因素,其变化影响着鱼类代谢等各种生理、生化活动。而代谢调节的变化能在一定程度上反映鱼类在不同环境下的生理状况,可作为衡量鱼类对盐度胁迫适应能力的重要生理指标。为了解低盐胁迫对大菱鲆肝脏代谢调节的影响,探讨大菱鲆在低盐环境养殖的可能性,本文对大菱鲆肝脏抗氧化酶和转氨酶活性在低盐胁迫(0ppt)下的变化进行了测定和分析。结果显示,在低盐胁迫下四种代谢酶活性均作出反应,过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)随时间均呈先下降后上升的趋势,均在第12小时活性最低,并显著低于第0小时和第48小时(P<0.05);谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)随时间均呈先下降后上升的趋势,均在第24小时活性最低,并显著低于第0小时和第48小时(P<0.05)。研究显示四种代谢酶活性在大菱鲆适应低盐胁迫初始阶段显著降低,但随后迅速升高并恢复,表明大菱鲆可能具有较强的低盐适应能力。2.盐度胁迫会造成鱼类体液中离子/渗透稳态失衡,进而对代谢等生理活动产生影响,因此当盐度变化时,鱼类会进行渗透调节,以保持鱼体正常的水盐平衡和代谢等生理活动,而通过渗透调节基因控制各种离子和水的进出是其重要的渗透调节方式之一。基于课题组早期通过转录组分析筛选得到的多种渗透调节相关基因,本文从中挑选了4种具有代表性的渗透调节基因,包括囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)、Na+/H+-exchanger(NHE)和水通道蛋白(AQPs)AQP1及AQP3,研究其在大菱鲆鳃、肾、肠三个主要渗透调节器官中对低盐胁迫的响应。本研究采用荧光定量PCR技术对四种基因在5盐度和10盐度下不同时间点的大菱鲆鳃、肾、肠中表达量进行检测。结果显示,AQP1表达量在鳃中极少(P<0.05),在肾和肠中较高,低盐胁迫下,5盐度组和10盐度组在鳃中的表达量无显著变化,在肾和肠中均显著上升(P<0.05)。AQP3表达量在肾中极少(P<0.05),在鳃中较高,在肠中较少,低盐胁迫下,5盐度组和10盐度组在肾中的表达量无显著变化,在鳃和肠中均显著上升(P<0.05)。CFTR表达量在肾中极少,在鳃中较高,在肠中较少,低盐胁迫下,5盐度组和10盐度组在肾中的表达量无显著变化,在鳃和肠中均显著下降(P<0.05)。NHE1在鳃和肠中表达量较少,在肾中较高,低盐胁迫下,5盐度组和10盐度组在鳃中的表达量无显著变化,在肾和肠中均显著上升(P<0.05)。这些结果表明四种基因表达水平因组织、盐度和时间的不同而不同,反映了这四种基因的功能特异性;在低盐胁迫下,四种基因积极响应,表达量均发生不同程度变化,表明AQP1、AQP3、CFTR和NHE1在大菱鲆低盐环境适应中可能具有重要作用。3.鱼类对环境盐度变化的适应与许多信号转导通路相关,而14-3-3蛋白可以和多种配体蛋白结合并发挥调节作用,在多种信号转导通路的调控中起到重要的枢纽作用。因此上述基因对低盐胁迫的响应可能受到14-3-3蛋白的调控。为进一步了解大菱鲆渗透调节机制,以及14-3-3蛋白是否参与调控NHE1、CFTR和Na+-K+-ATPase(NKA)对低盐胁迫的响应,我们克隆并分析了大菱鲆14-3-3beta/alpha的c DNA序列,探讨了14-3-3beta/alpha组织分布以及低盐胁迫下在主要表达组织中的转录模式,此外,我们首次在大菱鲆体内通过肌肉注射ds RNA的方法使14-3-3beta/alpha沉默,以此为基础研究了14-3-3beta/alpha对NHE1、CFTR和NKA在低盐胁迫下表达的调控作用,并为从个体水平研究基因功能提供一条新的有效途径。研究表明14-3-3beta/alpha基因c DNA全长892bp,包含774bp的ORF,推测一级结构为257个残基。推导的氨基酸序列与其他真核生物共享高度保守的结构。荧光定量PCR结果显示,14-3-3beta/alpha转录物在大菱鲆各组织中均有表达,在鳃中的表达量最为丰富(P<0.05),肾、肠、脑、脾表达较少,垂体等组织表达极少。在低盐胁迫下,大菱鲆14-3-3beta/alpha的表达随胁迫时间的延长呈先升高后降低的趋势,在12h达最高值(P<0.05)。注射不同浓度ds RNA后,14-3-3beta/alpha的m RNA表达量明显下降,其中注射4μg/g的ds RNA后12h干扰效果最好。此外,该基因的干扰会引起多种离子通道蛋白表达的改变,如NKA和NHE1的降低和CFTR的增加。因此,14-3-3beta/alpha可能是大菱鲆鳃中渗透调节信号转导的重要分子调节器。