背景Peutz-Jeghers综合征(PJS)是一种以皮肤粘膜黑斑、胃肠道多发息肉为特征的常染色体显性遗传病,其临床发病率为1/20万。早期研究认为,PJS息肉为错构瘤或增生性息肉,一般认为癌变的几率很小。随着研究的深入,人们发现有PJS息肉为腺瘤样息肉,可发生癌变,错构瘤本身也可能演变为腺瘤和癌,即存在着由错构瘤→腺瘤→腺癌的演变过程。国内外研究表明:PJS患者消化道息肉发生恶变及在消化道外发生恶性肿瘤的风险明显高于正常人群,总的肿瘤发生率在23%,其家族恶性肿瘤发病率也较普通人群高15倍。因此对参与PJS息肉的发生、恶变的因素进行研究具有重要意义。现已知肿瘤形成过程中主要存在着4种不同信号途径的异常,即WnT/wingless途径,K-ras途径,β-TGF途径和p53途径。最新研究表明结肠癌的发生发展中起重要作用的p53,APC,K-ras12基因,均非PJS息肉发生、发展中的重要分子基础。因此我们着眼于与之可能相关的WnT/wingless途径进行研究。β-catenin是这一途径中的关键分子。β-catenin基因(CTNNB1)定位于人染色体3P21.3-P22,该区域是人类基因组常导致恶性改变的区域,基因全长23.2Kb,共有16个外显子,其mRNA长度为3362个核苷酸残基。其3号外显子突变导致β-catenin蛋白降解减少,在胞浆内聚集,并进入核内,与转录因子Tcf/Lef结合,引起下游相关基因如c-myc、cyclin D1等转录,导致细胞增殖、分化失去控制,促使肿瘤的发生。许多肿瘤都涉及β-catenin基因的突变、缺失和蛋白表达的改变或转位,而β-catenin蛋白转位又是细胞向恶性转变的原因之一,尤其是其向细胞核转移后可启动相关基因的转录。β-catenin基因的改变在大肠腺瘤发生,特别是腺瘤癌变过程中发挥着重要的作用,β-catenin蛋白的异常表达可能是大肠腺瘤癌变的早期重要环节。目前国内外对PJS中β-catenin基因突变及其蛋白表达的研究较少。研究目的通过研究PJS患者体内β-catenin基因突变及其蛋白表达,结合临床病理特征,探讨β-catenin在PJS息肉发生及恶变中的作用,为进一步临床诊治及预后判断提供实验依据。材料与方法1、PJS临床病理特征研究:回顾性分析2001～2007年我院确诊的71例PJS患者的临床及病理资料特点,结合文献报道,探讨更完善的临床诊治及随访方案。2、β-catenin基因突变检测:收集12例PJS息肉组织、14例结肠腺瘤组织、14例结肠癌组织、12例癌旁正常粘膜组织,及相应PJS血液标本,针对β-catenin基因第三外显子设计引物,通过PT-PCR,基因测序,检测PJSβ-catenin基因突变。3、β-catenin蛋白表达检测:选取PJS息肉、结肠腺瘤、结肠癌、结肠正常粘膜组织各20例,通过免疫组化SP法检测PJSβ-catenin蛋白表达部位及阳性率。结果1、71例PJS患者中,有明确家族史者26例,占36.6%。病理以错构瘤为主,可与腺瘤性息肉、增生性息肉、幼年性息肉、炎症性息肉等多种类型息肉并存,合并恶性肿瘤者5例,占7.0%,家族直系亲属中发生恶性肿瘤者9例,占12.7%。2、PJS息肉组织RT-PCR结果凝胶图像目的基因[OD/内参IOD值(β-catenin IOD/GAPDH IOD)为1.044±0.331,与结肠腺瘤(0.917±0.207),结肠癌(1.109±0.283),癌旁正常组织(1.000±0.386)相比,差异无显著性(OnewayAnova分析,F=0.972,P=0.414＞0.05),四组间β-catenin mRNA水平无显著差异。3、检测10例PJS息肉组织样品RT-PCR扩增产物中,7例(70%)出现编码区431位碱基缺失突变(缺失A),8例(80%)非编码区184位插入突变(插入T),2例(20%)非编码区189位插入突变(插入A)。3例PJS肠道正常粘膜中,2例431位碱基缺失突变(缺失A),1例184位碱基插入突变(插入T)。2例PJS家族正常成员中,1例421位碱基缺失突变(缺失A),2例184位碱基插入突变(插入T)。检测6例PJS血液白细胞RT-PCR扩增产物中,3例(50%)出现431位碱基缺失突变(缺失A),2例(33.3%)421位碱基缺失突变(缺失A),4例(66.7%)出现184位碱基插入突变(插入T)。4、PJS、腺瘤、腺癌及正常组织中,β-catenin蛋白膜表达、胞浆表达、核表达及整体异位表达具有显著差异。其中:膜表达缺失率分别为30.0%、45.0%、75.0%和5.0%,经R×Cχ~2检验,差异具有显著性(χ_P~2=21.646,P=0.000＜0.05);胞浆阳性表达率和表达强度呈增加趋势,经多组等级资料的秩和检验方法(Kruskal-Wallis H),差异具有显著性(χ~2=30.584,P=0.003＜0.05);胞核阳性表达率分别为60.0%、30.0%、80.0%、5.0%,经R×Cχ~2检验,差异具有显著性(χ_P~2=26.565,P=0.001＜0.05);总的异位表达率分别为60.0%、50.0%、90.0%、5.0%,经R×Cχ~2检验,差异具有显著性(χ_P~2=29.769,P=0.000＜0.05)。结论1、除错构瘤性息肉外,PJS患者还可合并存在有腺瘤性息肉、增生性息肉、幼年性息肉等多种类型息肉。PJS是一种癌易感综合征,不仅患者有一定癌变倾向,其家族肿瘤患病率也明显高于正常人群。2、PJS、腺瘤、腺癌及正常组织中,β-catenin蛋白膜表达、胞浆表达、核表达及整体异位表达差异具有显著性。PJS息肉组织中β-catenin蛋白正常膜表达减少,膜表达缺失率升高,胞浆表达阳性率及强度增加,核表达阳性率增加,整体异位表达率升高,提示β-catenin蛋白表达异常可能是PJS息肉形成、腺瘤变及恶变的特征之一。3、与正常粘膜、腺瘤、腺癌相比,PJS息肉组织中β-catenin mRNA水平无显著差异,提示PJS患者β-catenin蛋白胞浆内异常聚集并非mRNA表达量增高所致。4、PJS息肉组织中β-catenin基因第三外显子突变较为常见,以编码区431位碱基的缺失突变和非编码区184位碱基的插入突变居多。编码区突变导致框移突变,使终止密码子提前出现;非编码区突变可能导致蛋白合成调节异常。在相应血液白细胞和息肉旁正常组织及家族正常成员中也检测到相应突变,提示PJS不仅存在体系突变,也存在胚系突变。341、321、184、189这四个碱基位点可能是PJS有别于其他肿瘤的新的突变位点。