论文部分内容阅读
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种革兰氏阴性杆菌,可长期定植于胃部,与胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃癌等多种胃肠道疾病有关。己糖激酶2（hexokinase-2,HK2）是糖酵解的关键酶,能够催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸,与癌细胞生长和代谢有关。HK2在结直肠癌、肝癌、肺癌等多种癌症中呈高表达,并且HK2可能通过促进癌细胞的侵袭、增殖和迁移而促进肿瘤发展。有研究指出,HK2在胃癌组织中表达水平增高,且与胃癌患者预后有关,可能在胃癌的发生发展过程中起重要作用。另有研究显示H.pylori CagA蛋白与胃癌的发生发展紧密相关。目前,CagA蛋白是否通过影响胃黏膜上皮细胞HK2表达而参与胃癌的致病尚不清楚。探明该问题对进一步揭示H.pylori感染致癌机制具有重要意义。目的本研究通过H.pylori与胃黏膜上皮细胞共培养实验、细胞转染实验及构建H.pylori感染动物模型,探讨H.pylori菌体及其CagA蛋白对胃上皮细胞HK2表达的调控作用,为H.pylori感染致癌机制和胃癌的早期诊断研究提供基础。方法1.H.pylori NCTC11637 cag A基因缺失菌株的鉴定:培养H.pylori NCTC11637 cag A+和前期构建的H.pylori cag A-菌株,提取两种菌株的基因组DNA和菌体蛋白,通过PCR和Western blot的方法鉴定H.pylori cag A+和H.pylori cag A基因敲除菌株。2.H.pylori与胃上皮细胞共培养实验:（1）将感染复数（Multiplicity of infection,MOI）分别设定为50:1、100:1和200:1,用H.pylori cag A+菌株与胃上皮细胞GES-1及胃癌细胞SGC-7901共培养24 h,检测细胞中HK2 m RNA表达水平。（2）MOI为200:1时,分别用H.pylori cag A+和cag A-菌株与GES-1和SGC-7901细胞共培养6 h、12 h和24 h,检测细胞中HK2 m RNA的表达水平。3.H.pylori cag A基因转染细胞实验:实验组用携带cag A基因的重组质粒转染胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞SGC-7901,对照组用质粒pc DNA 3.1（+）转染细胞,转染后48 h检测两组细胞中HK2 m RNA和CagA蛋白的表达水平。4.H.pylori感染蒙古沙鼠实验:将蒙古沙鼠随机分为3组（H.pylori cag A+组、H.pylori cag A-组和对照组）,H.pylori cag A+组和H.pylori cag A-组分别用H.pylori NCTC11637 cag A+和NCTC11637 cag A-菌液灌胃,对照组用保种液灌胃,隔日灌胃1次,共5次。于末次攻击后4、8、12、16周后取沙鼠胃组织,通过q PCR检测沙鼠胃上皮细胞HK2 m RNA表达水平。结果1.H.pylori NCTC11637 cag A基因缺失菌株鉴定结果:经PCR扩增cag A基因和Western blot检测CagA蛋白,证明前期构建的H.pylori cag A基因敲除菌株中cag A基因缺失,而未经基因敲除的H.pylori NCTC11637菌株cag A基因呈阳性。2.H.pylori与胃上皮细胞共培养实验结果:（1）以不同MOI（MOI=50:1、100:1、200:1）,H.pylori NCTC11637 cag A+菌株与胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞SGC-7901共培养24 h:MOI不同的实验组HK2 m RNA水平均高于对照组（P<0.001）;MOI=200:1组HK2 m RNA水平高于MOI=100:1和MOI=50:1组（P<0.001）;MOI=100:1组HK2 m RNA表达水平高于MOI=50:1组（P<0.001）。（2）H.pylori与GES-1和SGC-7901细胞共培养不同时间的检测结果:H.pylori cag A+和cag A-菌株与细胞以MOI=200:1共培养6 h时,在GES-1细胞中,H.pylori cag A+组HK2 m RNA表达高于对照组（P<0.001）;H.pylori cag A-组HK2m RNA表达低于对照组（P<0.001）;H.pylori cag A+组HK2 m RNA表达高于H.pylori cag A-组（P<0.001）;在SGC-7901细胞中,H.pylori cag A+组和H.pylori cag A-组HK2 m RNA表达均高于对照组（P<0.001）;H.pylori cag A+组与H.pylori cag A-组HK2 m RNA表达无统计学差异（P>0.05）。H.pylori cag A+和H.pylori cag A-菌株与GES-1和SGC-7901细胞以MOI=200:1共培养12 h和24 h时,H.pylori cag A+和H.pylori cag A-组HK2 m RNA表达水平均高于对照组（P<0.001）,且H.pylori cag A+组HK2 m RNA表达水平高于H.pylori cag A-组（P<0.001）。3.pc DNA-cag A重组质粒转染细胞实验:用重组质粒pc DNA-cag A和质粒pc DNA 3.1（+）分别转染GES-1和SGC-7901细胞,于转染后48 h,Western blot检测到CagA蛋白表达,结果表明重组质粒pc DNA-cag A转染成功;GES-1和SGC-7901细胞在转染48 h后,与pc DNA 3.1（+）组相比,pc DNA-cag A组HK2m RNA表达水平升高（P<0.001）。4.H.pylori感染沙鼠胃组织检测结果:（1）于H.pylori感染沙鼠后4周,H.pylori cag A+和cag A-组HK2 m RNA表达水平与对照组相比均无统计学差异（P>0.05）;H.pylori cag A+组HK2 m RNA表达水平与H.pylori cag A-组无统计学差异（P>0.05）。于H.pylori cag A+和cag A-菌株感染沙鼠后8周,H.pylori cag A+和cag A-组HK2 m RNA表达均高于对照组（P<0.05）;H.pylori cag A+组HK2 m RNA表达与H.pylori cag A-组无统计学差异（P>0.05）。于H.pylori感染沙鼠后12周,H.pylori cag A+组HK2 m RNA表达高于对照组（P<0.05）,H.pylori cag A-组HK2 m RNA表达与对照组无统计学差异（P>0.05）;H.pylori cag A+组HK2 m RNA表达与H.pylori cag A-组无统计学差异（P>0.05）。于H.pylori感染沙鼠后16周,H.pylori cag A+和cag A-组HK2 m RNA表达均高于对照组（P<0.001）;且H.pylori cag A+组HK2 m RNA表达高于H.pylori cag A-组（P<0.001）。结论1.H.pylori与细胞共培养实验及细胞转染实验结果均表明,H.pylori CagA蛋白可上调胃黏膜上皮细胞HK2的表达。2.H.pylori感染动物实验证明,H.pylori CagA蛋白可上调沙鼠胃上皮细胞HK2的表达。3.研究提示,H.pylori CagA蛋白可能通过影响胃黏膜上皮细胞HK2的表达参与胃癌的发生发展进程;此外,在H.pylori菌体中除CagA蛋白外可能还存在其它调节HK2表达的因子。