油菜菌核病是由核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）引起的一种分布较广、破坏性较强的世界性病害，该病不仅减少了油菜的产量，而且降低了油菜的品质，给世界油菜生产造成了严重的经济损失。目前，油菜菌核病仍是以化学防治为主。但是随着单一杀菌剂的长期使用，田间抗性菌株分布范围逐年扩大，抗性群体比例不断上升，最终导致了该病防效下降。咯菌腈(fludioxonil)是一种苯吡咯类非内吸性广谱杀菌剂，对油菜菌核病具有较好的田间防治效果。而目前，咯菌腈用于油菜菌核病的防治在我国尚未进行登记，同时，咯菌腈对核盘菌的作用机制尚不清楚。因此，本文开展了咯菌腈对油菜菌核病菌的作用机制研究，探索了油菜菌核病菌对咯菌腈的抗性机理。　　本文测定了咯菌腈对油菜菌核病菌的毒力及作用方式，结果表明:咯菌腈对油菜菌核病菌具有较高的杀菌活性，测定的270个菌株的平均EC50为0.015±0.003μg/mL。咯菌腈对油菜菌核病菌菌丝生长具有强烈的抑制作用，能使菌丝细胞膨大、原生质收缩、外渗;在生理生化特性上也表现出明显的变化:细胞膜透性、菌丝甘油含量、POD和PAL活性显著增加，但草酸及胞外多糖含量则显著降低;咯菌腈在油菜上没有内吸疏导性，对油菜菌核病具有显著的保护治疗作用，且保护作用高于治疗作用。　　通过室内药剂驯化获得油菜菌核病菌对咯菌腈抗性菌株，这些菌株抗性能稳定遗传，对菌核净、异菌脲、嘧霉胺、甲基立枯磷存在交互抗性，但与苯并咪唑类杀菌剂多菌灵无交互抗性;咯菌腈抗性菌株生长速率减慢，菌丝干重下降，产菌核能力降低，致病力下降，对渗透压（高糖、高盐）较为敏感;细胞膜透性、甘油含量、草酸量、PAL和POD活性显著增加，但是胞外多糖含量并没有显著差异。　　在粗糙脉孢菌和小麦赤霉菌中，os-1、os-2、os-4和os-5基因与二甲酰亚胺类药剂抗性有关，在灰霉菌中，只有os-1与二甲酰亚胺类药剂抗性有关，且二甲酰亚胺类药剂与苯吡咯类药剂存在正交互抗性。因此，对油菜菌核病菌双组分组氨酸激酶途径中的4个关键激酶基因进行鉴定及克隆，分别命名为:Shk1(SS1G_12694)、SsHOG1(SS1G_07590)、SsOS4(SS1G_06598)和SsOS5(SS1G_14143)。同时，对实验室诱导的咯菌腈抗性菌株及其亲本菌株的Shk1、SsHOG1、SsOS4和SsOS5基因分别进行克隆、测序比对，结果显示仅在Shk1基因上发生了点突变或移码突变。我们也测定了咯菌腈、菌核净对油菜菌核病菌双组分组氨酸激酶途径中4个激酶基因的表达影响，结果显示:药剂处理后，Shk1及SsOS4基因表达均显著下调，而SsHOG1及SsOS5基因表达均显著上调。　　通过双向电泳分离技术建立了油菜菌核病菌蛋白质双向电泳图谱，研究了咯菌腈对油菜菌核病菌蛋白质组学的影响。结果表明，在成功鉴定的33个蛋白点中，8个为能量代谢相关蛋白，7个为氨基酸代谢相关蛋白，5个为调控相关蛋白，14个为功能未知蛋白。但由于这些蛋白的功能大多在油菜菌核病菌上尚未报道，其功能还需进一步的验证。通过咯菌腈对野生型敏感菌株HA61蛋白质组的影响，分析咯菌腈对油菜菌核病菌可能存在的作用途径，为探索咯菌腈对油菜菌核病菌的作用机制具有重要的参考价值。　　本文初步建立了直接以菌丝为受体的核盘菌原生质体遗传转化技术体系，并构建了含有新霉素抗性基因的真核表达载体。将含有构巢曲霉（Aspergillusnidulans）trpC基因的启动区和终止区的潮霉素磷酸转移酶基因片段（HPH）和以双元表达载体pCAMBIA1300为基本骨架构建的含有新霉素磷酸转移酶基因（NEO）的表达载体pNEO分别转化至供试菌株中，PCR验正转化子。结果表明，制备核盘菌原生质体的条件:培养菌丝的最适培养基为YEPD;菌丝培养时间为36h;裂解酶为Lysingenzymes;最佳酶解缓冲液为0.8mol/L甘露醇的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。PCR验正转化子表明，HPH和NEO基因已成功插入转化子的基因组中。该技术体系不仅为研究核盘菌基因功能及构建核盘菌突变体文库提供一种重要的技术保障，而且也适用于其他病原丝状真菌。　　双组分信号途径参与调控渗透压和氧化压胁迫、菌丝生长、致病性和杀菌剂抗性等功能，有人推测，苯吡咯类药剂作用机制和抗性机理很可能与双组分信号途径密切相关。因此，在本研究中，利用油菜菌核病菌原生质体遗传转化技术平台，分别对油菜菌核病菌双组分信号途径中4个关键激酶基因Shk1、SsHOG1、SsOS4和SsOS5及p21蛋白活化激酶基因SsPAK进行了敲除，并对其进行了表型功能分析，结果表明:　　1.Shk1基因敲除突变体对渗透压及氧化压的敏感性增大，对苯吡咯类及二甲酰亚胺类杀菌剂的抗性增强;菌丝生长速率有所减慢、菌丝顶端分支增多，菌丝生长致密，气生菌丝增多，不能形成菌核;菌丝细胞膜透性显著增大。菌丝甘油测定结果显示Shk1基因调控着甘油的合成和积累。通过对SsHOG1和SsPAK基因的荧光定量PCR测定表明，Shk1基因调控着SsHOG1基因的表达，而对SsPAK基因的表达则无影响。与亲本菌株相比，Shk1缺失突变体对寄主植物的致病力上没有显著差异。通过互补试验，Shk1缺失突变体的所有生物学表型都得到了恢复。综上所述，Shk1基因参与调控着菌丝生长分化、菌核形成、渗透压敏感性、杀菌剂抗性等;同时，也调控着菌丝胞内甘油的合成、积累及SsHOG1基因的表达。　　2.SsOS4敲除突变体菌丝生长缓慢，菌丝较细，不形成菌核，完全丧失致病力;对NaCl和葡萄糖产生的渗透压、过氧化氢产生的氧化压及所有金属离子胁迫均表现为敏感，而对苯吡咯类药剂咯菌腈和二甲酰胺类药剂菌核净和异菌脲表现为抗性。在细胞膜透性上，SsOS4敲除突变体始终大于亲本菌株，但用药剂处理后，亲本菌株HA61细胞膜透性显著增大，而SsOS4敲除突变体变化幅度较小。qRT-PCR结果表明:与亲本菌株相比，SsOS4敲除突变体中SsHOG1和SsOS5基因的表达量均上升。在药剂处理下，SsOS5和SsHOG1基因的表达量在亲本菌株中均显著上升，而在SsOS4敲除突变体中无显著变化。通过互补试验，SsOS4缺失突变体的所有生物学表型都得到了恢复。由此我们得出，SsOS4基因参与调控着菌丝生长分化、菌核形成、各种外界胁迫压力的敏感性、杀菌剂抗性及致病力等功能。　　3.SsOS5敲除突变体菌丝扭曲畸形，顶端分支增多，致病力显著下降，但生长速率无变化;对NaCl产生的离子渗透压、过氧化氢产生的氧化压及锌离子胁迫均表现为敏感，对葡萄糖产生的中性渗透压及其它金属离子胁迫敏感性无变化;对苯吡咯类药剂咯菌腈和二甲酰胺类药剂菌核净表现为更加敏感。在细胞膜透性上，SsOS5基因敲除后，细胞膜的通透性并无变化;当用药剂处理后，亲本菌株的细胞膜透性显著增大，而SsOS5敲除突变体则无显著变化。在菌丝甘油合成上，SsOS5敲除突变体菌丝甘油含量大于亲本菌株。当用药剂处理后，亲本菌株菌丝甘油含量显著增加，而SsOS5敲除突变体菌丝甘油含量无显著变化。qRT-PCR结果表明:SsHOG1基因在SsOS5敲除突变体与亲本菌株的表达水平上无差异，但在药剂处理后，SsHOG1基因在亲本菌株上的表达量显著上升，而在SsOS5敲除突变体上的表达量显著下降，表达量较微弱。通过互补试验，SsOS5缺失突变体的所有生物学表型都得到了恢复。这说明SsOS5基因是致病相关基因，参与调控着菌丝的生长与分化、渗透压敏感性等功能。　　4.SsHOG1敲除突变体菌丝扭曲畸形，顶端分支增多，但致病力，生长速率及外界胁迫压力的敏感性均无变化，对苯吡咯类药剂咯菌腈和二甲酰胺类药剂菌核净和异菌脲敏感性降低。在细胞膜透性上，，sHOG1敲除突变体大于亲本菌株，当用药剂处理后，亲本菌株的细胞膜透性显著增大，而SsHOG1敲除突变体则无显著变化。在菌丝甘油合成上，SsHOG1敲除突变体与亲本菌株菌丝甘油含量无差异。当用药剂处理后，两者菌丝甘油含量均显著增加。　　5.SsPAK基因敲除突变体对NaCl产生的离子渗透压、过氧化氢产生的氧化压及苯吡咯类及二甲酰亚胺类杀菌剂的敏感性均增大;对不同的金属离子胁迫也表现出不同的敏感性;但菌丝生长速率、菌丝及菌落形态、菌核形成及致病力上却无变化。在细胞膜透性测定上，SsPAK基因敲除突变体对杀菌剂压力胁迫无变化，而野生菌株则显著升高。菌丝甘油测定结果显示SsPAK基因参与调控着甘油的合成和积累。通过对SsOS4、SsOS5和SsHOG1基因的表达测定，结果表明:SsPAK基因敲除后，SsOS4和SsOS5基因显著上升，而SsHOG1基因表达则不变化。通过互补试验，SsPAK缺失突变体的所有生物学表型都得到了恢复。　　6.这些结果表明，油菜菌核病菌上述基因的功能与其他病原真菌相应的基因功能存在较大的差异。由于SsOS4和SsOS5基因是致病相关基因，因此，它们可以作为开发新型药剂的新靶标。　　综上所述，咯菌腈对油菜菌核病菌的作用机制可能是:咯菌腈激活了油菜菌核病菌双组分组氨酸激酶途径，导致胞内甘油合成增加并积累，使胞内膨压增大，电解质浓缩、外渗，细胞膜透性增大，从而导致细胞破裂死亡。