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目的:天然免疫存在于所有多细胞生物,是抗御病原体感染的第一道防线。单核细胞和树突状细胞(dendritic cell, DC)是其中重要的效应细胞,作为体内重要的抗原提呈细胞(antigen present cell, APC),具有探测微生物,产生细胞因子,调节机体免疫反应的能力。新生儿免疫系统发育不成熟,尤其是先天免疫发育不健全,调节性T细胞功能不完善,Th1/Th2细胞比例失衡,免疫反应向Th2型偏斜,易患感染性疾病和变态反应性疾病。大量实验证实,肠道共生菌具有促进免疫系统成熟的能力,可激活免疫细胞,促进免疫活性细胞分泌细胞因子,维持Th1/Th2型细胞反应平衡,诱导免疫应答或免疫耐受。本研究采用细胞培养技术以肠道共生菌(双歧杆菌和大肠杆菌)为刺激物观察新生儿脐血单核细胞和单核细胞来源的DC的形态学和免疫学变化:1.观察双歧杆菌和大肠杆菌刺激单核细胞所致形态学变化和产生细胞因子IL-10和IL-12情况,探讨其对新生儿全身免疫的作用。2.观察双歧杆菌和大肠杆菌刺激DC后的形态学变化和产生IL-10和IL-12情况,探讨其对新生儿局部免疫的作用。研究结论为临床上合理应用微生态制剂预防和治疗新生儿感染性疾病和变态反应性疾病提供重要理论依据。方法:选取正常足月新生儿脐血20例(阴道分娩儿10例、剖宫产儿10例)。每份血样均采用甲基纤维素沉降脐血红细胞,利用Ficoll密度梯度法分离单个核细胞(cord blood monocular cells,CB-MNCs),经贴壁培养获得单核细胞。本实验分两部进行1收集部分单核细胞,分为4组,分别加入热灭活双歧杆菌、热灭活大肠杆菌、热灭活双歧杆菌+大肠杆菌和PBS液(对照组),培养24小时观察单核细胞形态学变化,取培养上清液ELISA法检测IL-10和IL-12p70浓度。2向部分贴壁的单核细胞中加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、IL-4联合诱导单核细胞生成DC,培养7天获得未成熟DC,后分为4组,分别加入热灭活双歧杆菌、热灭活大肠杆菌、热灭活双歧杆菌+大肠杆菌和PBS液(对照组)。每日倒置显微镜观察细胞形态学变化并摄片。取培养上清液行ELISA检测IL-10和IL-12p70浓度。统计学利用SAS 6.12版统计软件进行统计计算。采用两样本t检验、配对t检验和卡方检验,结果用均数±标准差( x±s )表示,以α=0.05为检验显著性标准。结果1双歧杆菌、大肠杆菌刺激单核细胞后,未发现形态学变化。2双歧杆菌、大肠杆菌刺激后单核细胞存活率与对照组无显著差异,各组存活率均>90%。3双歧杆菌、大肠杆菌对单核细胞刺激产生不同反应,未加任何刺激物时可分泌少量IL-10和IL-12p70。双歧杆菌刺激24h后,IL-10和IL-12p70分泌量明显增高,以IL-12p70增高为著,与对照组比较均有统计学差别(p<0.05)。大肠杆菌刺激24h后,IL-10分泌量显著增多,与对照组和双歧杆菌组比较均有统计学差别(p<0.05),产生IL-12水平低于双歧杆菌组(p<0.05)。两种菌联合刺激后出现,IL-12水平与双歧杆菌组接近(p>0.05),高于大肠杆菌组(p<0.05)。IL-10水平明显高于两单独刺激组(p<0.05)。说明两种菌联合刺激使IL-12、IL-10分泌均保持较高水平。4体外培养7天可得到未成熟DC,呈悬浮状态,体积明显变大,呈多形性,边缘呈毛茸状,可见小的突起。双歧杆菌和大肠杆菌刺激24小时后突起明显增多,可见刺状突起及多级突起,并得到有典型树突状突起的成熟DC,较对照组有明显差别。5双歧杆菌、大肠杆菌刺激对DC的存活率与对照组无显著差异,各组存活率均>90%。6未成熟DC在未加任何刺激物时可分泌少量IL-10和IL-12p70,双歧杆菌刺激24h后,IL-10和IL-12p70分泌量有所增加,与对照组比较均有统计学差别(p<0.05),以IL-10增加显著。大肠杆菌刺激后,IL-10分泌量显著增多,高于对照组和双歧杆菌组(p<0.05),IL-12水平较对照组增高(p<0.05),与双歧杆菌组相似(p>0.05)。两种菌联合刺激后则出现,IL-12的水平有所增加,与对照组比较有统计学差别(p<0.05),与双歧杆菌组相似(p>0.05),低于大肠杆菌组(p<0.05)。但IL-10水平增高明显,均高于对照组和两单独刺激组(p<0.05)。结论1证实了体外分离、培养足月新生儿脐血单核细胞和单核细胞来源的树突状细胞的技术是成熟和成功的。2双歧杆菌通过促使新生儿单核细胞分泌IL-12,使免疫反向Th1方向发展,调节Th1/Th2免疫应答平衡,激活新生儿免疫功能,增强机体抗感染能力,降低变态反应性疾病的发生。3双歧杆菌、大肠杆菌通过促使树突状细胞分泌IL-10,诱导口服耐受,维持肠道自稳状态,并促使sIgA、IgM等抗体生成,抑制变态反应性疾病的发生。4双歧杆菌、非致病性大肠杆菌作为肠道共生菌不引起机体的排斥反应,不影响单核细胞和树突状细胞的存活,可作为益生菌诱导产生口服免疫耐受。5肠道共生菌能够调节新生儿先天性和获得性免疫,调节免疫应答平衡,增强全身和局部免疫功能,对新生儿感染性疾病和变态反应性疾病有预防和治疗作用,为临床上早期使用微生态制剂预防和治疗新生儿疾病提供了理论依据。