核糖体蛋白L9(RPL9)参与组成核糖体大亚基,在许多物种中均已被发现,现已知该基因与哺乳类动物的生长发育联系密切,近年来,有关RPL9基因及其对脂肪生成的调控机理已经成为分子生物学的研究热门。RPL9基因不仅参与蛋白质的合成,也可能参与调控脂肪细胞的分化和平衡脂肪酸代谢的调节,从而影响脂肪积聚。因此,本试验对小鼠RPL9基因进行了初步的基因序列及功能分析,为深入研究RPL9基因的功能及作用机制提供参考依据,也为进一步进行脂肪生成相关基因的研究奠定基础。主要研究内容如下:1小鼠RPL9基因的克隆。Genebank注册的小鼠RPL9基因的序列号为NM—011292.2,参照此序列号设计该基因的引物,模板为小鼠肝脏组织cDNA,进行PCR扩增小鼠RPL9基因编码序列,全长为579bp。扩增产物经连接、转化、筛选、测序等,测序结果表明该序列与已知序列比对的同源性为98.45%,表明小鼠RPL9基因被成功克隆。2小鼠RPL9基因生物信息学分析。采取不同的生物信息学分析软件及在线工具对小鼠RPL9基因的核酸组分、酶切位点、氨基酸序列、氨基酸理化性质、氨基酸疏水性、蛋白跨膜区等进行全方位的分析,并预测RPL9蛋白的二级结构及三级结构,分析结果RPL9基因共编码192个氨基酸,该基因GC含量为48.88%,AT含量为51.12%,受到CpG甲基化影响的酶切位点共有9个,受其它甲基化影响的酶切位点有3个,仅编码4种氨基酸,其中丙氨酸比重最高占28.2%,其次为甘氨酸27.8%,苏氨酸23.0%,半胱氨酸含量为21.1%,亲水区明显多于疏水区,该基因编码的氨基酸序列中不存在跨膜蛋白及信号肽,二级蛋白结构中的α螺旋占36.46%,β折叠占30.73%,无规则卷曲占25.0%,预测出三级结构的稳定模型,均表明该基因进化保守。3小鼠RPL9基因差异性表达。分别取15日龄、60日龄小鼠的心、肝、脾、肺、肾及脂肪等六种组织的RNA,测定浓度后反转录,利用荧光定量PCR检测各组织RPL9基因的表达量差异。检测结果15日龄小鼠肾脏组织中的RPL9基因表达量最高,心、肝、脾及脂肪组织中的表达量次之,肺中的表达量相对最低,60日龄小鼠心脏RPL9基因表达量最高,肺、肾、肝及脾的表达量呈现逐步下降的趋势,脂肪组织RPL9基因表达量最低。同一组织RPL9基因表达量15日龄小鼠均高于60日龄小鼠,其中15日龄小鼠与60日龄小鼠的脂肪组织中RPL9基因的表达量差异极显著(P<0.01),表明该基因可能促进小鼠的生长发育,且对小鼠脂肪组织的生长分化关系密切。4小鼠RPL9蛋白差异性表达。以15日龄、60日龄小鼠心、肝、脾、肺、肾和脂肪等六种组织经裂解、离心后取蛋白上清,进行浓度检测、稀释、BCA定量、上样、电泳、转膜、孵一抗、孵二抗、ECL发光、显色等过程,结果表明15日龄小鼠肾中RPL9蛋白表达量最高,心、肝和脾蛋白表达量稍高,肺和脂肪的蛋白表达量稍低,60日龄小鼠心、肺、肾中表达量较高,脾的RPL9蛋白表达量较低,脂肪组织RPL9蛋白表达极低,这也印证了RPL9基因可能在某种程度上促进小鼠个体生长发育。5体外培养小鼠脂肪细胞并诱导分化。体外培养幼龄小鼠腹部脂肪细胞,传代,至第三代进行诱导分化,模拟了小鼠在不同发育阶段的体内脂肪细胞生长、分化、成熟的过程。6小鼠脂肪细胞中RPL9基因的差异表达。复苏并离心脂肪细胞,利用实时荧光定量PCR检测不同发育阶段小鼠脂肪细胞的表达量差异,发现在生长时期的脂肪细胞RPL9基因表达量升高,对脂肪细胞的生成起促进作用。对小鼠RPL9基因及其基因功能的研究结果表明,该基因在小鼠不同生长发育时期的表达对脂肪的生长分化发挥不同的作用,为我们进一步研究该基因对脂肪生成的相关分子调控机理提供了理论依据。