近年来,寨卡病毒、H7N9禽流感病毒以及埃博拉病毒感染的相继爆发给全世界人民带来了极大的恐慌。持续的疫情及严峻的防控局势,使得病毒性疾病的预防和治疗工作变得十分紧迫。而深入了解宿主抗病毒效应机制是解决这个问题的关键,也是病毒性疾病预防和治疗药物开发的前提和基础。当机体受到病毒、细菌、寄生虫、真菌感染的时候,机体释放的I型干扰素可以通过直接或者间接的方式在免疫调控尤其是抗病毒免疫中发挥重要作用,是目前已知最重要的抗病毒分子。研究表明:干扰素可以通过诱导下游数百种干扰素诱导基因(ISGs)的表达来发挥抗病毒功能,然而到目前为止仍有许多ISGs的功能有待进一步探索。为此本研究将以ISGs为主要研究对象,筛选其中具有重要抗病毒作用的基因并初步探讨其作用的分子机制。本课题组首先采用重组人干扰素α对人外周血单核细胞进行刺激,通过高通量RNAseq技术对245,000个转录本进行系统筛查,从中发现嘌呤类受体家族重要成员P2Y14的表达显著提高,呈现出典型的干扰素诱导基因特征。随后我们在小鼠巨噬细胞中利用荧光定量PCR的方法进一步验证干扰素对P2Y14的诱导表达,而TLR3的敲除以及STAT1的抑制均可以显著降低由Poly(I:C)或者IFNβ诱导的P2Y14表达。同时病毒的感染可以显著上调P2Y14的表达以及其内源性配体UDPN的大量释放。提示P2Y14及其相关信号通路在病毒感染过程中可能具有的重要作用。为进一步明确P2Y14在病毒感染中的重要作用,我们利用P2Y14特异性配体UDPN分别预处理病毒感染的细胞和小鼠,并通过QPCR以及免疫荧光技术明确了 UDPN对于病毒感染的抑制作用。为了探究UDPN的抗病毒机制,我们运用CRISPR/cas9技术构建了 P2Y14基因敲除的小鼠,并分别在细胞及动物水平发现P2Y14缺失后会明显促进病毒的感染。同时在细胞水平上发现:P2Y14缺失之后,UDPN就不能抑制HSV-1的感染,表明UDPN所具有的抗病毒作用是由P2Y14所介导的。为进一步探究UDPN/P2Y14的抗病毒机制,我们通过QPCR检测技术发现UDPN及P2Y14对IFNβ的表达没有明显影响,表明UDPN/P2Y14的抗病毒作用不依赖于I型干扰素。随后我们采用ELISA、QPCR、Western blot实验技术检测到病毒感染会显著促进cAMP以及下游信号蛋白EPAC1的表达,而且UDPN能够显著抑制由Forskolin激活的cAMP水平。此外我们运用QPCR、结晶紫染色等技术发现阻断cAMP及EPAC1信号通路会显著抑制病毒的复制。同时在EPAC1敲除的Hela细胞系中我们发现,EPAC1敲除可以显著抑制UDPN的抗病毒功能。这些结果初步表明UDPN/P2Y14可能通过抑制cAMP/EPACl信号通路发挥抗病毒功能。随着对胞外危险信号以及嘌呤受体研究的不断深入,胞外核苷酸所具有的免疫调控作用越来越受到重视,本研究立足于RNA-seq技术高通量筛选的干扰素诱导基因,以病毒感染过程中胞外UDPN的释放及其受体P2Y14表达上升为切入点,从细胞及小鼠体内的角度对UDPN/P2Y14抗病毒的功能进行系统评价,并对其作用的分子机制进行了初步探讨,为深入理解机体的抗病毒机制奠定基础,并为基于胞外核苷酸及其受体的抗病毒药物研发提供理论依据。