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目的:根据世界卫生组织(WHO)的报告,非传染性疾病(NCD)或慢性疾病(CD),例如心血管疾病、癌症、糖尿病和慢性呼吸道疾病,是造成全球死亡的主要原因。此外,由于人们的平均预期寿命正在增加,因此其发病率正在上升并接近流行病的比例。缺血性卒由于其高发病率及高致残率已经严重威胁人类身体健康及生命质量。缺血性卒中急性期首选治疗策略仍是动静脉溶栓或取栓治疗,但是由于缺氧复流后再灌注损伤以及部分病患就诊时错过时间窗,因此深入探讨缺血性卒中神经细胞凋亡及坏死机制,并研发可作用靶点仍是人们不断探索的方向。藁本内酯(ligustilide,LIG)为从中药材川芎、当归中提取的苯酞类化合物,具有能够通过血脑屏障并且有抗癌、抗炎、抗肝毒性和泌尿系保护作用。本项研究采用体外培养PC12细胞,通过建立OGD/R模型,我们探讨了LIG对OGD/R诱导的PC12细胞损伤的保护作用,及是否可以通过自噬来对抗OGD/R诱导的PC12细胞凋亡并且深入探讨在此作用中相关的信号通路。为中药有效成份LIG对于急性缺血性脑血管病神经损伤的保护作用提供一定的理论依据。研究方法:1、培养和传代PC12细胞,取对数生长期PC12细胞进行传代,培养条件DMEM-F12培养基,37℃,5%CO2。制备OGD/R模拟缺血性卒中再灌注损伤模型。2、MTS方法检测氧糖剥夺不同时间(3h、12h、24h、48h)对PC12细胞增殖活性影响,测取OD值的平均值,n>3。3、倒置显微镜观察不同浓度的LIG(10-5-10-9M),处理不同时间(3h、12h、24h)对PC12细胞形态的影响。4、流式细胞仪检测氧糖剥夺不同时间(3h、12h、24h、48h)对PC12细胞凋亡的影响。5、流式细胞仪检测加入自噬通路抑制剂3-MA,AMPK抑制剂Dorsomorphin对细胞凋亡的影响。6、免疫荧光检测PC12细胞内自噬相关蛋白LC3-II的表达。7、电子透射显微镜检测PC12细胞内自噬小体的表达。8、Western blot检测LIG(10-6M)预处理OGD/R诱导的细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达情况。9、Western blot检测LIG(10-6M)预处理后自噬相关蛋白LKB1、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、m TOR、p-m TOR的蛋白表达。10、检测加入通路抑制3-MA对LKB1、p-LKB1、AMPK、p-AMPK、m TOR、p-m TOR蛋白的表达影响。结果:1、PC12细胞在DMEM-F12培养基(10%胎牛血清,1%的青链霉素)内生长铺满瓶底达对数生长期,以相应比例进行传代。2、浓度为0,10-5~10-9M的LIG预处理0、3、12、24h后,结果发现预处理3h后10-5、10-6、10-7M的LIG对于细胞的增殖活性均有明显改善作用(与OGD/R模型组相比较,P<0.05)。因此,我们选择LIG预处理(10-6M,3h)作为后续试验的浓度及时间切入点。3、流式细胞仪检测PC12细胞凋亡。在OGD/R条件下,在不同时间(3h、12h、24h)诱导PC12细胞凋亡;LIG明显降低OGD/R诱导的PC12细胞凋亡率。4、流式细胞仪检测OGD/R诱导PC12细胞凋亡,用3-MA抑制自噬后,凋亡率显著升高;加入AMPK抑制剂Dorsomorphin后,Dor-组的凋亡率增加,应用自噬及通路抑制剂后LIG的保护作用减弱。这些结果再次证明了自噬参与了LIG的神经保护作用,它减弱了OGD/R诱导的细胞凋亡。5、经OGD/R(12h)处理后,细胞核周围自噬相关蛋白LC3-II少量积聚,经LIG处理后,LC3-II的表达和分布明显增强。自噬抑制剂3-MA可部分逆转此过程,表明LIG能够提高PC12细胞的自噬水平。6、电子透射显微镜检测PC12细胞内自噬小体,LIG在PC12细胞中上调自噬。7、Western blot检测显示,LIG增加OGD/R处理后的PC12细胞Bcl-2的蛋白表达,降低Bax的蛋白表达。8、LIG+OGD/R组AMPK活化(磷酸化)显著增加,AMPK上游激酶LKB1(磷酸化)显著增加,从而表明LIG具有上调LKB1和AMPK活性的能力;而该组m TOR磷酸化降低,LIG可能通过LKB1-AMPKm TOR信号通路诱导自噬水平加速。结论:1、预处理浓度为10-6M LIG预处理细胞3h后,能明显的抑制OGD/R诱导的PC12细胞凋亡;2、LIG通过上调Bcl-2蛋白表达和下调Bax蛋白表达抑制PC12细胞凋亡;3、LIG可以通过上调自噬水平抑制凋亡,起到神经保护作用;4、LIG通过增加自噬作用来抑制OGD/R诱导的PC12细胞凋亡,并可能通过LKB1-AMPK-m TOR自噬信号途径的激活实现。