背景：临床上，缺氧缺血仍然是造成足月儿、近足月儿严重脑损伤的主要原因之一，其发生率（二和三级脑损伤）约为0．1-0．2％，其中约20％患儿死亡，高达40％幸存者遗留严重神经系统后遗症，如痉挛性麻痹，智力障碍，癫痫等。迄今为止，仍没有十分有效的临床手段能减轻脑损伤和改善此类患儿的预后。早期研究发现，缺氧缺血导致新生鼠和成年鼠神经细胞死亡的方式有显著差异。在新生鼠，由于神经细胞发育的不成熟，缺氧缺血早期阶段死亡以坏死为主，后期则以凋亡为主；而在成年鼠，神经细胞则主要发生坏死。这种差异很大程度上与新生脑组织具有较高的凋亡诱导激酶Caspase-3活性有关。由于对缺氧缺血十分敏感且受其增殖和再生能力的限制，一旦启动坏死、凋亡程序且未经干预，不成熟神经细胞终将死亡，即使动物幸存下来，其躯体感觉和记忆功能也受到极大影响。胰岛素样生长因子I（IGF-1）是一种多肽类神经营养因子，它对于哺乳动物神经系统的发育发挥十分重要的作用。IGF-1和其受体的表达在神经分化过程中达到顶峰，IGF-1通过激活其受体，促进神经细胞生存、分化、增殖、突触外伸以及髓鞘形成。研究表明，在7天的大鼠和胎羊，缺氧缺血后立即心腔内注射IGF-1能为神经细胞提供保护作用。我们前期的研究结果表明，缺氧缺血后24和48小时皮下注射IGF-1可显著减轻缺氧缺血诱导的不成熟鼠脑损伤，并且在2个月后能够明显改善它们的记忆和认知行为发展的潜能。然而，若干瓶颈阻碍了IGF-1进一步试用于临床：1．在新生大鼠缺氧缺血动物模型，即使在缺氧缺血发生后立即心腔内注射大剂量的IGF-1，三天后，脑损伤仅能减少40％左右；2．缺氧缺血后延迟（6小时以后）给予IGF-1治疗效果不确定；3．IGF-1对脑和行为学发展的远期效果不明了。在缺血再灌注诱导的脑损伤中，氧化损伤扮演了重要角色。相对于成熟脑组织而言，新生脑组织由于含有高浓度的铁离子，较低水平的谷胱苷肽过氧化物酶，并伴有H₂O₂的积累，导致其对缺血后氧化应激性损伤特别敏感。通过对小脑颗粒神经细胞的研究表明，高水平的H₂O₂除了本身的神经毒性以外，它还可诱导神经细胞产生对IGF-1保护作用的抵抗。那么，这种对IGF-1的抵抗是否是导致缺氧缺血后立即给予IGF-1治疗不佳的重要因素?目前尚不清楚。为此，我们希望采用一种抗氧化剂与IGF-1联合应用的方式以对缺血缺氧性神经细胞发挥足够保护作用。首先由抗氧化剂清除蓄积的ROS，消除神经细胞的氧化应激状态，恢复其对IGF-1神经营养作用的敏感性，然后，IGF-1得以发挥其保护功能和营养作用。丙酮酸钠正是这样一种药物，它具有：1．本身没有毒副作用，不会对细胞造成新的损伤；2．能够很容易的进入细胞内，在胞内胞外均能发挥作用；3．具有良好的抗氧化功能，能够清除ROS，消除缺氧缺血性发生后的氧化应激状态；4．与IGF-1有协同作用，能恢复细胞对IGF-1的反应性，增强IGF-1对缺氧缺血后细胞的保护作用。目的：尽管目前对缺氧缺血后脑损伤的机制有了进一步认识，但是我们对新生儿缺氧缺血性脑病仍然缺乏有效的临床治疗手段。IGF-1能够减少缺氧缺血性脑病动物模型的脑损伤，但是以一种时间依赖的方式。我们初期的数据显示，缺氧缺血后IGF-1在恢复的早期阶段疗效较低是由于氧化应激诱导了神经细胞的IGF-1抵抗。为此，我们进一步阐明：1、氧化应激诱导神经细胞IGF-1抵抗的机制；2、联合采用抗氧化剂治疗恢复神经细胞对IGF-1的敏感性后，是否能增强IGF-1对缺氧缺血诱导不成熟脑损伤的治疗作用。方法：1、原代培养的新生大鼠大脑皮层神经元细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞，待生长至第六天时，将培养液换成高糖DMEM，分别加入不同浓度的H₂O₂，4小时后，用Western-blot检测神经元细胞cleaved Caspase-3，Caspase-3，IGFIR，Gapdh的表达，24小时后，分别检测各种细胞LDH，MTT的变化。2、原代培养的新生大鼠大脑皮层神经元细胞，待生长至第六天时，将培养液换成高糖DMEM，分别加入不同浓度的H₂O₂，5分钟后，IGF-1组加入25ng／ml IGF-1，对照组不加IGF-1，45分钟后，Western-blot检测P-Akt（Ser473），Akt，P-P38，P38表达变化；2小时后，Western-blot检测P-JNK（Thr183／Tyr185）、JNK、P-FOXO3（Ser253）、P-FOXO3（Thr32）、FOXO3、P-P53（Ser392）、P53、Acetyl-H3、Acetyl-4、Gapdh等的表达；4小时后，用Western-blot检测两组细胞cleaved Caspase-3，Caspase-3，IGFIR，Gapdh，P-P53（Ser392），P53表达变化，用real-time PCR检测IGFIR，Gapdh的表达变化；24小时后，分别检测两组细胞LDH，MTT的变化。3、分别以Akt、JNK2、p38和P53特异性阻断剂LY294002（20uM）、SP600125（20uM）、SB239063（7．5uM）和Pifirin（10uM）作为干预方式，分别于相应的时间点运用相应的方法检测上述指标的改变。4、原代培养的新生大鼠大脑皮层神经元细胞，待生长至第六天时，将培养液换成高糖DMEM，分别加入不同浓度的H₂O₂，2小时后，用细胞裂解液提取细胞蛋白，分别以TBP和P53作为免疫共沉淀（IP）蛋白，用IB检测P-P53（Ser392）和HDAC1表达的变化。5、原代培养的新生大鼠大脑皮层神经元细胞，待生长至第六天时，将培养液换成高糖DMEM，分别加入不同浓度的H₂O₂，分别于5分钟和1小时后加入IGF-1，45分钟后用Western-blot方法检测P-Akt，Akt表达的变化。6、原代培养的新生大鼠大脑皮层神经元细胞，待生长至第六天时，将培养液换成高糖DMEM，分别加入不同浓度的H₂O₂，5分钟后丙酮酸钠组加入2mM丙酮酸钠，IGF-1组加入25ng／ml IGF-1，丙酮酸钠+IGF-1组同时加入二者，45分钟后，Western-blot方法检测P-Akt（Ser473），Akt表达变化，4小时后，Western-blot方法检测IGFIR，Gapdh，cleaved Caspase-3，Caspase-3表达变化，并检测细胞培养液LDH的变化。结果：1、大脑皮层神经元细胞对氧化应激损伤异常敏感H₂O₂对神经元细胞，少突胶质细胞，星形胶质细胞LDH和MTT均有的影响，但对神经元细胞的影响更加显著。2、H₂O₂对皮层神经元细胞的毒性作用呈剂量依赖性H₂O₂使神经元细胞细胞培养液中LDH明显上升，MTT明显下降，cleavedCaspase-3表达明显上升，且呈明显的H₂O₂剂量依赖性。3、IGF-1对皮层神经元细胞的凋亡具有保护作用IGF-1使皮层神经元细胞LDH明显降低，cleaved Caspase-3表达显著降低。4、高浓度H₂O₂能够抑制IGF-1对皮层神经元细胞的保护作用高浓度的H₂O₂能够使IGF-1组和无IGF-1组皮层神经元细胞LDH，MTT和Caspase-3的表达无显著性差异。5、提高IGF-1的浓度并不能克服H₂O₂诱导的皮层神经元细胞IGF-1抵抗当H₂O₂浓度达到60uM时，无论何种浓度的IGF-1均不能使神经元细胞LDH降低。6、H₂O₂诱导皮层神经元细胞P38激活，加入IGF-1无法阻断这一过程H₂O₂显著升高神经元细胞磷酸化P38MAPK的表达，P38MAPK特异性的抑制剂SB239063能够抑制这种升高。而加入IGF-1并无影响。7、H₂O₂通过激活P38，从而阻断皮层神经元细胞Akt的磷酸化（Ser473）H₂O₂呈剂量依赖性的下调神经元细胞P-Akt（Ser473）的表达。8、IGF-1通过激活Akt（Ser473），从而钝化FOXO3（Thr32），但是这一过程能被高浓度的H2O2阻遏IGF-1显著增加神经元细胞P-Akt（Ser473）的表达，并且使P-FOXO3（Thr32）表达明显升高。但当加入高浓度的H₂O₂，IGF-1的作用即被抑制。9、H₂O₂对皮层神经元细胞Akt磷酸化（ser473）的抑制作用是可逆的，且其对IGF-1诱导的Akt（Ser473）磷酸化的阻遏作用亦可扭转当加入H₂O₂ 5分钟后加入IGF-1，可见P-Akt（Ser473）升高并不明显，而当加入H₂O₂ 1小时后加入IGF-1，则可见P-Akt（Ser473）显著升高。10、H₂O₂通过磷酸化JNK2（Thr183／Tyr185），从而激活FOXO3（Ser253）IGF-1可以显著增加P-JNK2（Thr183／Tyr185）的表达，并明显增加P-FOXO3（Ser253）的表达。11、H₂O₂对大脑皮层神经细胞IGF-1受体的影响是神经元细胞特异性的H₂O₂明显下调神经元细胞IGF-1受体的表达，但是对少突胶质细胞和星形胶质细胞IGF-1的表达没有显著影响。12、H₂O₂呈剂量依赖性诱导皮层神经元细胞P53的激活，并且这种激活作用具有时效性H₂O₂能够呈剂量依赖性的明显升高P-P53（Ser392）的表达，且这种作用在2小时达到高峰，4小时逐渐下降。13、H₂O₂通过激活P53，从而降低皮层神经元细胞IGF-1受体的表达H₂O₂明显减少神经元细胞IGF-1受体的表达，但当加入P53的抑制剂Pifithrin，IGF-1受体的表达明显升高14、磷酸化P53（Ser392）通过结合于TBP而影响IGF-1受体mRNA的转录H₂O₂能使P-P53（Ser392）与TBP的结合显著增加，从而影响转录15、H₂O₂诱导HDAC1与P53结合从而影响组蛋白3和组蛋白4乙酰化H₂O₂能使HDAC1与P53结合显著增加，并且明显下调乙酰化组蛋白4的表达，而对乙酰化组蛋白3却没有明显影响。16、在氧化应激状态下，丙酮酸钠能使大脑皮层神经细胞恢复对IGF-1的敏感性在H₂O₂存在的条件下，丙酮酸钠能使P-Akt（Ser473）表达明显升高，当同时加入丙酮酸钠和IGF-1，丙酮酸钠能显著上调IGF-1对P-Akt（Ser473）的刺激作用17、在氧化应激状态下，丙酮酸钠能减弱H₂O₂对大脑皮层神经细胞IGF-1受体的抑制作用在H₂O₂存在的条件下，丙酮酸钠能使神经元细胞IGF-1受体的表达明显升高。18、在氧化应激状态下，丙酮酸钠对大脑皮层神经元细胞LDH和活化Caspase-3表达的影响在H₂O₂存在的条件下，丙酮酸钠能使神经元细胞LDH明显下降，同时使激活的Caspase-3表达明显减少。表明丙酮酸钠能减少H₂O₂诱导的神经元细胞凋亡。结论：1、氧化应激首先激活应激酶P38，阻断了IGF-1／AKT信号通路的神经保护作用，随后激活另一应激酶JNK2，使AKT和JNK2两条独立通路之间的平衡被打破，从而激活神经转录因子FOXO3，触发了细胞凋亡级联反应；2、氧化应激状态下，P53首先被激活，激活的P53使IGF-1受体表达下调，是氧化应激诱导IGF-1抵抗的重要原因之一；3、氧化应激状态下，丙酮酸钠能够有效清除ROS，恢复神经细胞对IGF-1的敏感性，与IGF-1联合应用可增强IGF-1对神经细胞的保护作用。