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1、本研究采用PCR扩增获取鸡的IL-2、IL-18基因,将其插入pMD18-T载体中进行测序鉴定。对含有S1、M、N目的基因的pIBVS1、pIBVM、pIBVN质粒进行测序分析。结果表明,IL-2、IL-18、S1、M、N基因全长分别为432bp、536bp、1671bp、678bp和1230bp,鉴定的目的基因正确。以pDsRed-Express-N1载体为骨架,以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site)序列为连接元件构建绿色和红色荧光基因的双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red,转染Vero细胞后观察到绿色和红色荧光基因均获得表达。构建的pIRES-EGFP/Red载体含有卡那霉素抗性基因,比含有氨苄抗性的双顺反子载体具有更高的生物安全性,为今后开展各种病原微生物双顺反子DNA疫苗的研制提供研究工具。2、用S1、M、N基因与IL-2、IL-18基因分别替换pIRES-EGFP/Red质粒中的荧光基因,构建双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIPES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIPES-M/IL18和pIRES-N/IL18及其单基因表达质粒,转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。RT-PCR检测表明转染了重组质粒的Vero细胞中均能特异的扩增出S1、M、N和(或)IL-2、IL-18基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了重组质粒的细胞显示出黄绿色荧光,而转染了空质粒的细胞则没有显示出任何特异荧光。本研究为IBV结构基因和细胞因子双顺反子DNA疫苗免疫试验提供了材料。3、采用本课题组获得专利(专利号为200410081443.4)的质粒提取、纯化方法制备质粒,将质粒溶液(1mg/mL)与脂质体溶液(10mg/mL)等体积混合配制成DNA疫苗。将配制的DNA疫苗通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,28日龄加强免疫一次。分别在免疫前和免疫后7、14、21、28、35d采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量。二免后两周用IBV强毒进行攻毒。ELISA抗体水平结果显示:pIRES-S1/IL2、pIPES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组产生的抗体水平高于pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组,在免疫后14-35d,差异显著(P＜0.05);pIRES-M/IL18、pIPES-N/IL18疫苗组产生的抗体水平也高于pIpES-M、pIRES-N疫苗组,在免疫后14-35d,差异显著(P＜0.05),pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组产生的抗体水平与pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18疫苗组相比在免疫后21-35d差异显著(P＜0.05):外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组在免疫后7-28d,与pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组相比差异显著(P＜0.05),pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18疫苗组在免疫后14-28d CD3+、CD4+T、CD8+T淋巴细胞亚群的数量高于pIRES-S1、pIRES-M、pIRES-N疫苗组,差异显著(P＜0.05)。pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量较pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18 DNA疫苗组高,但差异不显著(P＞0.05)。攻毒结果表明,双顺反子DNA疫苗组的保护率介于65%～85%,其中RES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的保护率分别为85%和75%,高于混合质粒pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18 DNA疫苗组的70%和60%。其中pIRES-S1/IL2疫苗组的保护率85%高于灭活疫苗组的攻毒保护率75%。本研究研制出的IBV结构蛋白与IL-2、IL-18双顺反子DNA疫苗,为提高IBV DNA疫苗的免疫效率提供了新的途径。4、采用RT-PCR获取IBV E基因,用以替换pIRES-M/Red质粒中的红色荧光基因,构建双顺反子表达质粒pIRES-M/E,转染Vero细胞后进行表达检测。采用本论文第三章的方法制备DNA疫苗和进行动物免疫试验。结果表明:在免疫后7-35d,pIRES-M/E免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量高于pIRES-M组,但差异不显著(P＞0.05);pIRES-M/E、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为55%和40%,且低于灭活疫苗的攻毒保护率(75%)。本研究构建了IBV的M基因和E基因双顺反子DNA疫苗并对其免疫原性进行了研究,结果初步认为E基因对M基因免疫的协同作用不明显。5、采用RT-PCR方法对IBV mRNA3(3a3b3c)区域进行了克隆、测序及分子特性分析,测序表明3a3b3c片段大小为734bp,包含完整的3a、3b、3c(E)基因,与GenBank上公布的58株IBV毒株的相应序列的同源率介于78.2%～96.1%之间,与CK/CH/LGD/04II毒株和CK/CH/LSC/99I毒株的同源率最高(96.1%和95.9%)。对3a3b序列的RNA二级结构进行预测,结果表明两者具有相同的二级结构,但二级结构的稳定性存在差异。进一步构建3a3b的双荧光基因共表达质粒p3a3b-EGFP/Red,并对其IRES功能进行检测,结果没能检测到3a3b序列下游红色荧光基因的表达。本研究表明3a3b3c序列的分子特征与毒株的遗传变异存在相关性,为IBV的分子流行病学研究提供了新的途径。3a3b基因片段的内部核糖体进入位点功能要弱于脑心肌炎病毒的IRES序列,因此筛选高效的IRES序列用于新疫苗载体的构建还需要进一步研究。