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目的:研究原代低反应人群卵巢黄素化颗粒细胞体外培养及不同浓度DHEA对其分泌功能的影响;并通过不同浓度DHEA干预与正常人颗粒细胞有相似FSHR表达的KGN细胞株以探讨DHEA对颗粒细胞分泌功能影响的可能机制。方法:1.体外培养原代低反应人群卵巢黄素化颗粒细胞并以FSHR鉴定颗粒细胞:卵泡液来源于成都中医药大学第二附属医院生殖中心(2015年10月-2016年1月)行体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)或卵母细胞质内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治疗的卵巢低反应不孕患者。以40%Percoll分离液分离取卵术时收集的卵泡液,经红细胞裂解液裂解、PBS洗涤纯化分离后冻存颗粒细胞;以DMEM/F12培养基+15%FBS+1%青链霉素作为完全培养基培养复苏的颗粒细胞;通过细胞免疫荧光染色的方法以FSHR鉴定颗粒细胞。2.DHEA对体外培养的POR卵巢黄素化颗粒细胞分泌功能的研究:将收集分离而来的POR黄素化颗粒细胞分为五组于体外培养48h后,加入含不同浓度DHEA的完全培养基:阴性对照组(DHEA0um组)、DHEA0.05um组、DHEA0.5um组、DHEA5um组、DHEA10um组,干预24h,以化学发光法测定各组E2分泌量,以Western blot检测CYP19A1基因蛋白的表达。3.DHEA对KGN细胞株分泌功能及氧化应激的研究:1)氧化应激细胞模型的建立:将培养的KGN分为4组,分别以体积比为1/1000DMSO对照组(0um H2O2)、50um H2O2、100um H2O2、200um H2O2干预KGN细胞,MTT法检测H2O2对KGN细胞株活性的影响。由MTT结果得到H2O2最低有效干预剂量,而后以Western Blot检测H2O2最低有效干预剂量干预KGN细胞株后BCL-2、BAX蛋白表达,QPCR检测BCL-2m RNA、BAX m RNA的表达。2)DHEA对KGN细胞的干预:用DPPH法检测DHEA清除自由基的能力;将已培养48h的KGN细胞株分组,用不同浓度的DHEA:阴性对照组(DHEA 0um组)、DHEA0.05um组、DHEA0.5um组、DHEA5um组、DHEA10um组,分别干预处于不同氧化应激状态的KGN细胞株:0um H2O2、50um H2O2、100um H2O2并作用24h,以T-SOD试剂盒检测SOD活性,化学发光法测定E2分泌量,Western blot检测CYP19A1基因蛋白的表达,QPCR检测CYP19A1m RNA的表达。结果:1、体外培养的POR黄素化颗粒细胞与前期研究的正常人群黄素化颗粒细胞相似,颗粒细胞24h后呈单层贴壁生长,伸出伪足向梭形生长,培养48h后细胞形态饱满,内含较丰富的颗粒物质,达细胞增殖高峰。但整体上POR黄素化颗粒细胞较正常人群生长缓慢,培养相对更困难。2、体外培养48h后的POR卵巢黄素化颗粒细胞,加入不同浓度DHEA干预24h后,与阴性对照组相比,各干预组E2的分泌呈上升趋势,除DHEA0.05um组外,其余各干预组与阴性对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);DHEA0.05um与阴性对照组相比,E2分泌差异无统计学意义(P>0.05),但DHEA0.05um组CYP19A1蛋白的表达高于阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、DHEA对KGN细胞株分泌功能及氧化应激的研究:1)DHEA干预KGN细胞株时,其E2的分泌呈上升趋势,各干预组均明显高于阴性对照组(P<0.05)。2)氧化应激细胞模型的建立:与0um H2O2组相比,不同浓度的H2O2可使KGN细胞株生长活性降低,100um H2O2、200um H2O2对KGN生长明显抑制(P<0.05),100um H2O2为最低有效干预剂量。随着H2O2浓度增加BCL-2蛋白表达有降低趋势,BAX蛋白表达则有增加趋势,但其m RNA的表达无明显规律;3)DHEA对KGN细胞株的干预:i DPPH法检测DHEA,可见其较微弱的抗氧化作用。无论KGN细胞是否处于氧化应激状态,DHEA0.05um组SOD活性均高于阴性对照组(P<0.05)。ii DHEA0.05um组CYP19A1蛋白及m RNA的表达明显高于阴性对照组(P<0.05)。iii对100um H2O2的KGN组用DHEA干预,各DHEA浓度干预组CYP19A1蛋白的表达有下降趋势,DHEA0.05um组下降幅度低,但差异无统计学意义(P>0.05);各干预组CYP19A1m RNA的表达无明显规律。结论:1、本实验经分离、纯化得到的POR黄素化颗粒细胞纯度较高,证明该实验方案可行,为后续体外培养POR黄素化颗粒细胞提供可借鉴的培养方案。2、本实验中,POR颗粒细胞添加DHEA后,E2分泌整体呈上升趋势,但低浓度DHEA可能未过多的消耗CYP19A1的活性,使CYP19A1蛋白表达更容易表现出差异性;高浓度DHEA合成的E2更多,CYP19A1活性可能随底物浓度的增加活性下降;当底物达到一定浓度时,E2分泌不再增加。3、KGN细胞具有与POR卵巢黄素化颗粒细胞相似的分泌活性。氧化应激状态可影响KGN细胞活性增加其凋亡,凋亡可能是通过ERK凋亡通路实现。DHEA可能具有较弱的抗氧化作用,低浓度的DHEA干预KGN后,可能通过CYP19A1蛋白表达的增加表现出较弱的抗氧化活性,而这种抗氧化活性与SOD水平呈一致性。CYP19A1m RNA表达与卵巢反应性可能相关,低浓度的DHEA所表现出的抗氧化应激功能,可能主要是通过DHEA转化为E2过程时提高CYP19A1活性或增加其表达来实现的。4、本研究证实了DHEA对POR患者颗粒细胞E2分泌的作用,初步探讨了DHEA对POR患者卵巢功能改善的机制可能和底物浓度增加以及抗氧化有关,为临床患者应用DHEA提供试验基础。