论文部分内容阅读
目的:观察吸入麻醉药七氟醚对HT22小鼠海马神经元细胞DNA损伤的影响,以阐明七氟醚诱导发育脑神经毒性的可能机制。分组:选择HT22小鼠海马神经元细胞为研究对象,将细胞随机分为空白对照组、七氟醚组和N-乙酰半胱氨酸(NAC)组。空白对照组不做药物处理,七氟醚组使用不同浓度七氟醚(2%、4%、8%)处理海马神经元细胞6 h、12 h、24 h,NAC组使用5 mmol/L NAC预处理1 h,给予不同浓度七氟醚(4%、8%)处理海马神经元细胞12 h。方法:1、应用MTT法检测HT22小鼠海马神经元细胞存活率。2、应用LDH释放法检测HT22小鼠海马神经元细胞死亡率。3、应用单细胞凝胶电泳检测HT22小鼠海马神经元细胞DNA双链损伤。4、应用Western blot法检测HT22小鼠海马神经元细胞中DNA损伤相关蛋白8-OHd G、ATM、p-ATM和γ-H2AX的表达。5、应用DCFH-DA染色法分析HT22小鼠海马神经元细胞中活性氧(ROS)水平。结果:1、七氟醚导致HT22小鼠海马神经元细胞活性下降。与对照组比较,HT22小鼠海马神经元细胞经4%和8%七氟醚处理后细胞活性明显下降(P<0.01)。七氟醚呈剂量依赖性地抑制HT22小鼠海马神经元细胞存活。使用七氟醚处理HT22小鼠海马神经元细胞相同时间,随着七氟醚浓度的增加,HT22细胞存活率呈下降趋势(P<0.05)。七氟醚呈时间依赖性地抑制HT22小鼠海马神经元细胞存活。使用4%七氟醚处理HT22细胞6、12、24 h,随着时间的延长,HT22细胞存活率逐渐降低(P<0.05)。使用8%七氟醚处理HT22细胞6、12、24 h,HT22细胞存活率也随着时间的延长呈下降趋势(P<0.05)。NAC预处理能够减轻七氟醚对HT22小鼠海马神经元细胞的活性抑制。与4%和8%七氟醚组比较,NAC预处理组HT22小鼠海马神经元细胞存活率明显升高(P<0.01)。2、七氟醚导致HT22小鼠海马神经元细胞死亡。与对照组比较,HT22小鼠海马神经元细胞经4%和8%七氟醚处理后细胞死亡率明显升高(P<0.01)。七氟醚呈剂量依赖性地诱导HT22小鼠海马神经元细胞死亡。使用七氟醚处理HT22小鼠海马神经元细胞相同时间,随着七氟醚浓度的增加,HT22细胞死亡率逐渐上升(P<0.05)。七氟醚呈时间依赖性地诱导HT22小鼠海马神经元细胞死亡。使用4%七氟醚处理HT22细胞6、12、24 h,随着时间的延长,HT22细胞死亡率逐渐升高(P<0.05)。使用8%七氟醚处理HT22细胞6、12、24 h,HT22细胞死亡率也随着时间的延长呈上升趋势(P<0.05)。NAC预处理能够抑制七氟醚对HT22小鼠海马神经元细胞的损伤,降低细胞死亡率。与4%和8%七氟醚组比较,NAC预处理组HT22小鼠海马神经元细胞死亡率明显降低(P<0.01)。3、七氟醚导致HT22小鼠海马神经元细胞DNA双链断裂。单细胞凝胶电泳观察到七氟醚引起HT22小鼠海马神经元细胞DNA迁移延长,说明DNA双链损伤增多。与对照组比较,4%和8%七氟醚组HT22小鼠海马神经元细胞DNA迁移明显延长。NAC可减轻七氟醚对HT22小鼠海马神经元细胞DNA双链的损伤,NAC预处理使DNA迁移长度明显缩短。与4%和8%七氟醚组比较,NAC预处理组HT22小鼠海马神经元细胞DNA双链迁移长度明显减小。4、七氟醚呈剂量依赖性地诱导HT22小鼠海马神经元细胞DNA损伤相关蛋白8-OHd G、ATM、p-ATM、γ-H2AX表达。与2%七氟醚组比较,随七氟醚浓度增加,HT22小鼠海马神经元细胞DNA损伤相关蛋白8-OHd G、ATM、p-ATM、γ-H2AX表达量逐渐增加(P<0.05)。NAC预处理使DNA损伤相关蛋白8-OHd G、ATM、p-ATM、γ-H2AX表达明显减少。与4%和8%七氟醚组比较,NAC预处理组HT22小鼠海马神经元细胞DNA损伤相关蛋白8-OHd G、ATM、p-ATM、γ-H2AX表达量均降低(P<0.05)。5、七氟醚诱导HT22小鼠海马神经元细胞中ROS积聚。通过DCFH-DA染色观察到七氟醚引起HT22小鼠海马神经元细胞内绿色荧光表达增强,说明细胞中ROS积聚增多。与对照组比较,4%和8%七氟醚组HT22小鼠海马神经元细胞内ROS积聚明显增多(P<0.05)。七氟醚呈剂量依赖性地促进HT22小鼠海马神经元细胞中ROS积聚。与4%七氟醚处理12 h组比较,8%七氟醚处理12 h组HT22细胞中ROS积聚显著增加(P<0.05)。NAC可抑制七氟醚处理的HT22小鼠海马神经元细胞中ROS聚积,与4%和8%七氟醚组比较,NAC预处理组HT22小鼠海马神经元细胞中绿色荧光表达明显减少,ROS水平显著降低(P<0.01)。结论:1、七氟醚呈剂量时间依赖性地诱导HT22小鼠海马神经元细胞死亡,抑制其存活。2、七氟醚诱导DNA双链断裂,促进HT22小鼠海马神经元细胞内DNA损伤相关蛋白8-OHd G、ATM、p-ATM、γ-H2AX表达。3、七氟醚能够通过增加海马神经元细胞内ROS积聚,诱导DNA损伤,进而导致海马神经元细胞死亡。