目的:肝脏疾病是世界性的常见疾病,现有的治疗方法却不理想,基因治疗将可能是治疗最为有效方法。然而,目前肝病的基因治疗进展缓慢,其中最主要的因为是缺乏高效的、肝细胞特异性的载体。因此,研制出高效的嗜肝性基因治疗载体,是肝病基因治疗取得实质进展的关键。pre-S1蛋白含有HBV和肝细胞膜结合的位点,该位点位于第21～47位氨基酸,是重要的免疫介导部位,肝细胞、B细胞和T细胞均可表达针对这一肽段的受体,变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。本研究采用基因重组技术,将HBV表面蛋白中嗜肝性成分的基因编码作无免疫原性修改后,构建出携改良型HBVpre-S1基因表达载体,为下一步嗜肝性重组腺相关病毒微球的制备提供实验研究基础。　　 方法:以我国HBV流行株adr的DNA为模板,PCR法提取并扩增pre-S1的编码基因HBVpre-S1,然后将提取的HBVpre-S1基因用定点突变延伸的方法,通过两个独立的PCR扩增反应,将预设的突变构建在重叠区域,同时存在于两个扩增片段中,混合得到的两个重叠DNA片段,用两条分别与两个原始片段末端结合的引物进行第二次PCR扩增,将硬性较强的脯氨酸用柔性较大的丙氨酸替换,完成HBVpre-S1基因的突变。将突变后的HBVpre-S1基因片段通过双酶切,转化到制备好的DH5a感受态细胞中,在酚／氯仿抽提纯化,将重组质粒测序后,用醋酸锂法转化酵母细胞AH109后铺板于SD／Trp进行筛选。挑取(2～3)mm大小的菌落过夜培养后,提取酵母蛋白质,按常规方法分析表达产物并进行十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析。　　 结果:成功扩增出HBV流行株adr的HBVpre-S1基因片段,PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约357bp,基因测序结果显示序列完全正确,与预期片段符合,且无非特异扩增现象。通过片段重叠延伸法,成功将硬性较强的脯氨酸替换成柔性较大的丙氨酸,完成HBVpre-S1基因的突变。分别用限制性核酸内切酶EcoRI及PstI进行双酶切,连接到用相同酶切的pGBKT7质粒载体上,经酶切鉴定结果正确,重组质粒pGBKT7-HBVpre-S1构建成功。用醋酸锂法转化酵母后在SD／Trp培养基上筛选生长。培养数天后,挑取一菌落进行PCR扩增HBVpre-S1蛋白基因,结果显示转化成功。提取未转化质粒与转化后质粒的酵母蛋白质,进行SDS-PAGE和Western免疫印迹分析,结果显示对照无表达而转化了pGBKT7-HBVpre-S1的印迹分析可见明显目的条带且无杂带。　　 结论:1.成功扩增出HBVpre-S1基因片段。2.通过PCR体外定点突变,对位点ccc成功进行定点突变到gcc,三次PCR反应后在357bp附近出现单一的扩增条带,成功消除HBVpre-S1蛋白的免疫原性。3.用限制性核酸内切酶EcoRI及PstI进行双酶切,重组质粒pGBKT7-HBVpre-S1构建成功。4.重组质粒pGBKT7-HBVpre-S1转化酵母细胞AH109,在SD／Trp培养基上转化成功。