microRNA(miRNA)是一类长约为22个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA,普遍存在于真核细胞中。miRNA可以调控超过50%人类编码基因的活性,在生物发育、新陈代谢、细胞分化、凋亡和增殖等生物过程中发挥着至关重要的调控作用。作为疾病诊断和临床预测的一种潜在靶标,现有的检测方法大部分是使用常规的分析仪器对miRNA实现灵敏检测。然而,昂贵的实验设备和需要专业人员操作无法满足miRNA即时检测(point-of-care testing,POCT)的需求。即时检测是指采用便携设备,在采样现场,无需专业技术人员进行检测的技术。发展简单快速、灵敏可靠的检测miRNA的即时检测方法是非常有意义的。气压是一个常见的物理量,便携式气压计使用简单方便,无需专业人员即可操作。因此,以气压变化作为输出信号的生物分析法非常有利于发展成新型即时检测法。基于此,本论文建立了两种检测miRNA的气压型即时检测新方法,旨在实现对miRNA简单、快速、灵敏、可靠检测。本文的主要研究内容可总结为以下两方面:一、基于链替代信号放大灵敏检测miRNA的气压型即时检测法以便携式气压计作为检测工具,建立了一种高效、快速、灵敏检测microRNA21(miR-21)的即时检测法。发夹探针H1和H2分别修饰在磁珠(MBs)和铂纳米颗粒(PtNPs)表面,形成MBs-Hl和PtNPs-H2复合物。当miR-21存在时,DNA H1和H2之间的循环链替代反应(strand displacement reaction,SDR)被触发,会持续形成MBs-H1/PtNPs-H2复合物,使得很多PtNPs富集在MBs表面。将MBs-H1/PtNPs-H2复合物加入过氧化氢溶液中,PtNPs可以催化H2O2分解产生O2,在密闭的96孔板小孔里能产生很大的气压。根据便携式数显气压计测定气压值,可定量检测miR-21。气压值与miR-21浓度的对数值在10 fM至10 pM范围内具有良好的线性关系,检出限达到7.6 fM。设计使用具有分子识别高特异性的发夹探针和磁分离洗涤确保了检测的高特异性和可靠性,单碱基突变miR-21与目标miR-21区分明显。血清样品中的miR-21也可实现灵敏检测。该方法具有简单快速、可靠、超灵敏的特点,对miRNA即时检测发展具有重要的理论和实践意义。二、miRNA多组分同时检测的气压型即时检测法与单一生物标志物检测相比,生物标志物多组分同时检测不但可以提高疾病诊断的准确性,而且在简化分析程序、提高检测效率、降低成本等方面具有优势。发展同时检测多种生物标志物的方法,对于癌症早期诊断具有重要意义。基于此,以便携式气压计为检测工具,利用多通道纸芯片分区固定miRNA的捕获探针,结合环炉洗涤简化分离洗涤,建立了多种miRNAs同时检测的气压型即时检测法。首先,在纸芯片的不同区域固定与肺癌相关的4种miRNAs的捕获探针,当miRNAs存在时,捕获探针与miRNAs的一部分通过碱基互补配对进行杂交反应,同时标记有PtNPs的cDNA(PtNPs-cDNA)与miRNAs的另一部分也进行互补配对,形成稳定的“三明治”结构,这样使得纸芯片表面富集大量的PtNPs。然后,通过环炉洗涤同时清洗未进行反应的样品,以避免非特异性吸附。最后将不同区域的纸芯片剪切后加入过氧化氢溶液中,PtNPs可催化H2O2产生大量O2。根据气压值的变化可同时检测多种miRNAs。使用环炉洗涤大大简化了分离洗涤操作,实现了多通道同时洗涤,简单快速。该方法为同时检测miRNAs提供了一种简便、新颖的气压型即时检测法。