软骨病变是骨科较为常见的疾患。创伤、骨软骨炎、骨性关节炎、髌骨软化等均可引起软骨的病损。但关节软骨的病变难以自身修复，自1743年Hunter提出软骨一旦破坏即不可自身修复，两个半世纪过去了，至今软骨病变仍无理想的治疗办法，关节软骨的病变最终导致骨性关节炎而不得不接受关节置换。 组织工程软骨的研究为修复关节软骨的病变开辟了新途径。1987年瑞典人Britterg进行了第一例临床应用，目前全世界已经有超过10，000例，透明质酸钠和胶原膜复合自体软骨细胞构建的组织工程软骨已经作为产品推广应用。大量文献证明，利用组织工程软骨，能产生类似正常关节软骨的透明软骨组织，且大宗病例长期随访资料证明临床效果优良。 影响组织工程软骨质量的因素很多，但主要可以概括为三个方面：种子细胞、支架和构建方法。本课题的目的主要是通过比较研究寻找优化的制备组织工程软骨的技术方法，并为临床应用搭建技术平台。 自体软骨细胞是目前唯一应用于临床的软骨组织工程种子细胞，但成熟软骨细胞扩增困难，自体软骨组织取材有限，如何从极少量关节软骨组织中分离、培养并大量扩增出足够数量和优质的软骨细胞，是组织工程软骨临床应用的瓶颈。取材组织消化获取的原代软骨细胞的数量和活性直接决定了细胞扩增的时间周期、最终获得的细胞的数量、可传代次数和细胞的质量，从而进一步影响组织工程软骨修复的质量。本实验从兔的关节软骨做起，观察组织块剪切的大小、消化收集步骤以及胰酶和胶原酶浓度等对获取软骨细胞的影响，证明对少量关节软骨组织，用培养基配制的0.2％的胶原酶直接消化一步收集细胞的方法是比较优化的消化分离细胞的方法。成熟软骨细胞传3～4代后增殖逐渐缓慢，趋向停滞，无法达到组织工程软骨所需要的细胞数量，通过对软骨细胞培养中培养基、添加成份、血清及生长因子等方面的优化组合研究，表明添加了维生素C、脯氨酸、胰岛素、非必须氨基酸等成分的软骨博士论文:几种构建组织工程关节软骨方法的比较研究中国人民解放军军医进修学院细胞培养基对软骨细胞生长更有利。继之对8例成年人关节软骨细胞体外培养条件进行研究，结果表明使用20%胎牛血清效果优于10cy0;人AB血清优于胎牛血清;10%人血清的浓度是足够而且合适的;FGF一2、TGF一pl、PDGF一bb、HGF四种因子单独使用最佳促增殖浓度分别为:SOng/m1、ing/m1、Ing/ml、Zong/ml。sng/ml FGF一2与一ng/ml TGFpl组合是一种比较好的适于成年人关节软骨细胞生长的因子组合，它在促进软骨细胞增殖的同时，也较好的保持了软骨细胞的分化表型。 本实验通过在兔膝关节陈旧性软骨缺损模型上对三种自体软骨细胞移植方法—自体软骨细胞骨膜下注射、骨膜下细胞团块移植和细胞复合胶原支架的比较研究，我们发现骨膜下细胞团块移植是比较好的修复软骨缺损的手段，操作简单，修复效果好。 本实验用目前研究较多的三种支架—胶原、脱钙骨基质(DBM)和PLGA组成工程软骨，观察其对修复兔膝关节软骨陈旧性缺损的效果，结果表明胶原蛋白海绵是比较好的组织工程软骨支架材料，DBM需要进一步研究改进材料孔径，而PLGA由于其代谢产物的毒性作用，对关节软骨修复的效果较差。 由于自体关节软骨组织来源困难，造成关节再损伤，本实验利用藻酸凝胶包埋同种异体软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损，取得了很好的修复效果，表明同种异体软骨细胞作为软骨组织工程的种子细胞是可行的，可以作为对自体软骨组织取材困难、培养失败的替代方法;通过对脂肪组织来源干细胞的分离、培养、鉴定、定向分化过程及修复兔关节软骨缺损的实验研究，表明脂肪千细胞是较好的软骨组织工程干细胞来源。