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研究背景重链抗体(Heavy-chain antibodies, HCAbs)是一种新型的抗体类别,该类抗体缺失轻链和抗体CHI恒定区,仅由重链构成;其重链可变区(Variable domain of the H chain of Heavy Chain Antibody,VHH)的单一结构域构成了这类抗体的抗原结合位点,打破了重链和轻链共同构成抗体-抗原结合域的规则,尽管缺失轻链可变区,但仍具有完全的抗原结合力。自1993年Hamers发现单峰驼血清中天然存在重链抗体以来,研究者在全部骆驼科动物如单峰驼、双峰驼、羊驼等体内均证实了这类抗体的存在。利用基因工程技术克隆重链抗体的可变区可获得VHH抗体,也称为纳米抗体(Nanobody)。VHH纳米抗体是目前所发现的具有完整功能的最小分子抗体片段,分子量约为15kDa,仅为常规抗体的1/10。VHH纳米抗体具有分子量小、可溶性强、稳定性高、易于克隆筛选及人源化改造等独特优势,对疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。在前期研究中,我们通过噬菌体展示技术获得了人源抗CTGF单链抗体Anti-CTGF scFv (Genbank Access NO.GQ390339);实验研究显示 Anti-CTGF scFv 能够抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞表型的转换,并对博来霉素所致小鼠肺纤维化具有一定的抑制作用。前期Anti-CTGF scFv的研究为本研究提供了一定的基础,但肺纤维化疾病是多种病因引起的肺部破坏性疾病的终末期阶段,一般认为肺纤维化病程不可逆转且以早期肺炎症及肺损伤为特征,因此,在肺部病变改变的早期阶段进行药物干预或治疗具有更好的治疗效果。研究目的构建结缔组织生长因子VHH纳米抗体文库,筛选获取CTGF特异性的VHH纳米抗体;通过基因工程的方法表达制备高纯度的CTGF VHH纳米抗体;研究其在脂多糖诱导小鼠急性肺损伤中的作用,初步建立新一代基因工程抗体片段即VHH纳米抗体的研究方法,为进一步探索其临床价值提供依据。研究方法1.重组结缔组织生长因子C端(CT)抗原的制备:构建CTGF-C端(CT)原核表达载体,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,经镍亲和层析、肠激酶酶切等步骤制备目的蛋白CTGF-C端(CT),并进行SDS-PAGE、ELISA和Western Blot分析;CCK-8和Transwell实验考察其在细胞增殖和迁移中的活性。2.结缔组织生长因子VHH纳米抗体文库的构建:CTGF-C端(CT)蛋白免疫双峰驼,RT-PCR获得全套双峰驼VHH抗体基因,将其克隆到噬菌体载体并与编码噬菌体衣壳蛋白的基因相连接,展示于噬菌体表面,构建双峰驼VHH纳米抗体文库。3.CTGF特异性VHH纳米抗体的生物淘选:采用亲和淘选技术,包被纯化的重组抗原CTGF-C端(CT),进行“吸附-洗脱-扩增”的生物淘选,逐轮改变抗原包被浓度和洗涤压力,富集特异性结合CTGF-C端(CT)的噬菌体,从而筛选获得CTGF特异性VHH纳米抗体。4.CTGFVHH纳米抗体的表达纯化与活性的初步研究:构建VHH纳米抗体表达载体,转化大肠杆菌E.coliBL21 (DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,经镍亲和层析纯化制备VHH纳米抗体并检测其活性。5.CTGF VHH纳米抗体在脂多糖诱导小鼠急性肺损伤中作用的研究:气管内注射LPS诱导建立小鼠急性肺损伤模型(ALI),CTGF VHH纳米抗体干预ALI,给药24 h和48 h处死动物,分离肺部组织并收集肺泡灌洗液,观察肺组织病理改变、肺泡灌洗液细胞分类计数等指标,初步探讨CTGF VHH纳米抗体在LPS所致小鼠急性肺损伤中的作用。研究结果1.重组结缔组织生长因子C端(CT)抗原的制备:融合蛋白TrxA-His-CTGF-C在BL21(DE3)主要以可溶性形式表达,分离纯化获得了纯度大于95%的CTGF-C端(CT)蛋白。ELISA和Western Blot分析显示其与Anti-CTGF具有良好的结合活性。细胞实验显示,一定浓度的纯化CTGF-C端(CT)蛋白,可以促进人脐静脉内皮细胞和人近曲肾小管上皮细胞的细胞增殖和迁移。免疫学实验及细胞学实验显示,分离纯化所获目的蛋白CTGF-C端(CT)具有良好的生物活性,能够满足后续相关实验需求。2.结缔组织生长因子VHH纳米抗体文库的构建:免疫后双峰驼血清中抗CTGF抗体滴度水平达1:128,000;琼脂糖凝胶电泳显示,巢式PCR第二轮产物在约400 bp处有特异性条带,大小与VHH基因一致;将VHH基因片段用限制性内切酶NcoI-HF和NotI-HF消化后与噬菌粒载体pHEN2连接,电转化XL1-Blue感受态细胞,培养板阳性克隆子计数约为1.6×109, PCR鉴定VHH基因片段的插入率为93%,所构建VHH抗体库库容量为1.49×109CFU;随机挑取20个阳性克隆,测序结果均不相同,显示所构建VHH抗体库具有良好的多样性。3.CTGF特异性VHH抗体的生物淘选:测序结果显示,12个克隆测序中,其中9个克隆展示的核苷酸序列完全相同,转化为氨基酸序列后,命名为Nb1,即CTGF特异性纳米抗体(GenBank Access:NO.KX428017)。4.CTGFVHH纳米抗体的表达纯化与活性的初步研究:VHH纳米抗体在大肠杆菌以可溶性的形式表达,经镍亲和层析纯化获得该抗体纯度大于95%; ELISA实验表明,该抗体能和CTGF-C端(CT)特异性结合并具有较高的亲和力;且该抗体能够抑制CTGF-C端(CT)引起的促BEAS-2B、MRC-5和HLEF细胞的细胞增殖活性。5.CTGF VHH纳米抗体在脂多糖诱导小鼠急性肺损伤中作用的研究:气管内注射LPS后成功建立小鼠急性肺损伤模型,肺组织切片HE染色和Masson染色显示,该模型具有典型的肺泡结构的受损、萎缩甚至结构消失,肺组织内可见大量弥漫性炎性细胞的浸润等特征;在给予VHH纳米抗体干预后小鼠肺泡及间质炎症均明显减轻;肺泡灌洗液中性粒细胞计数较LPS模型组明显降低(P<0.05);同时,CTGFVHH纳米抗体明显降低了小鼠BALF和血清中TNF-α及IL-1β水平;与LPS模型组比较,VHH纳米抗体治疗组小鼠肺组织p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05),但未观察到磷酸化p65蛋白表达水平的明显改变。研究结论成功构建了库容量较高、基因多样性良好的噬菌体展示VHH纳米抗体文库;生物淘选获得CTGF特异性VHH纳米抗体;该抗体能够抑制CTGF-C端(CT)引起的促BEAS-2B、MRC-5和HLEF细胞的细胞增殖活性,并且能够LPS所致小鼠急性肺损伤中炎症和损伤程度,其分子机制可能与降低P65表达水平,抑制NF-κB信号通路有关。