脑血管病是危害人类健康的主要“杀手”,是导致成年人残疾的第一原因。在脑血管病中,以脑出血、脑血栓和短暂性脑缺血最为常见,该病具有发病率高、病死率高、致残率高、复发率高的特点。研究表明,脑缺血可以触发一系列复杂的病理级联反应,包括能量代谢异常、炎症反应、氧化应激、兴奋性氨基酸的毒性作用等,直接或者间接导致神经细胞凋亡/死亡,最终导致神经功能缺失。在脑缺血引发的复杂的病理损伤机制中,炎症反应是继发性脑损伤的重要原因之一。在缺血性脑损伤中,从受损的脑组织、血管和坏死细胞中释放的细胞因子激活Toll样受体(TLRs),诱导炎性细胞因子,如白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的合成与释放。这些细胞因子引起脑缺血后的炎症反应,进一步加重原发性脑损伤。炎症相关基因的表达不仅可以通过转录因子在转录水平上进行调控,还可以通过micro RNAs(mi RNAs)在转录后水平进行调控。近年的研究表明,mi RNAs可从多方面参与炎症的调节并影响脑缺血。在多种mi RNAs中,mi R-155是新近发现的一种与炎症反应相关的小分子RNA,其异常表达与癌症、心血管疾病、炎症、自身免疫病及移植排斥反应等疾病的发生有关。研究发现,mi R-155可直接参与巨噬细胞的炎症反应,也可通过NF-κB信号通路增强巨噬细胞促炎因子的表达。另外,mi R-155还可以通过靶向不同的炎症介质,如SHIP1、SOCS1、SMAD2和TAB2,起到促炎与抗炎的双重作用。鉴于mi R-155在脑梗死后炎症反应中的重要性,深入研究其在脑梗死损伤中的作用和机制,可为脑卒中的防治提供新的方向。近年来,在对神经保护剂的研究中发现,一些天然或合成的物质对缺血性脑组织具有很好的保护作用。旋覆花内酯(acetylbritannilactone,ABL)是从欧亚旋覆花中分离的一种抗炎单体化合物。以往研究用脂多糖(LPS)和IFN-γ触发单核/巨噬细胞(RAW264.7)、人血管内皮细胞(ECV304)和血管平滑肌细胞(VSMC)的炎症反应,证实ABL对3种细胞的促炎基因(包括COX-2、i NOS)和细胞黏附分子基因(包括VCAM-1、ICAM-1、OPN、MMP-2、MMP-9和黏蛋白-C)表达均具有显著抑制作用,能明显减轻炎症介质的合成、释放及血管炎性反应,并揭示其作用机制是通过特异性抑制NF-κB抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)活性和IκB磷酸化及降解,使IκB不能与NF-κB解离而阻止LPS/IFN-γ诱导的NF-κB核转位(即NF-κB活化)及与靶基因顺式元件的结合活性,进而起到抑制NF-κB依赖的促炎基因和细胞黏附分子基因表达的作用。ABL还能够抑制PDGF诱导的DNA合成和细胞增殖,并通过增高Bax/Bcl-2的比率,激活caspase-9/-3,导致血管平滑肌细胞的凋亡。虽然ABL在巨噬细胞和血管平滑肌细胞中表现出强有力的抗炎和抗增殖作用,但ABL在脑缺血中的作用尚未被揭示。同时,ABL在脑缺血中的抗炎作用是否是通过调制mi R-155表达而实现的,目前仍不清楚。本研究将分三部分对上述问题进行探讨,现将各部分内容概述如下:第一部分旋覆花内酯对小鼠脑缺血诱发的炎症反应的影响目的:观察ABL在缺血性脑损伤中的抗炎作用。方法:选用成年雄性CD1小鼠,采用改良线栓法制备MCAO小鼠模型。将CD1小鼠随机分为5组:假手术组(sham)、模型组(MCAO)、ABL小剂量组(ABL-L)、ABL中剂量组(ABL-M)、ABL大剂量组(ABL-H)。Sham组:除不插入尼龙线外其余操作同模型组。MCAO组:用线栓法制作右侧大脑中动脉闭塞模型。ABL干预组:在MCAO术前30min,腹腔注射ABL。小剂量组:ABL 10 mg/kg,中剂量组:ABL 20 mg/kg,大剂量组:ABL 30 mg/kg。将BV2小胶质细胞分为对照组(con)和氧糖剥夺处理组(OGD),氧糖剥夺处理组再分为用ABL(100μmol/L)预处理24 h和不用ABL预处理组。ABL预处理组预先用100μmol/L的ABL预处理BV2小胶质细胞24 h。脑缺血后24 h处死动物进行观察、检测。各组取材前进行神经功能评分、TTC染色评价梗死体积、干湿重法测定脑水肿;并应用免疫组化法、Western-blotting和q RT-PCR方法检测脑组织和BV2细胞中TNF-α、IL-1β、NF-κB、TLR-4以及I-κB、My D88和SOCS1的表达。1神经功能评分:MCAO组明显高于sham组(P<0.05);ABL处理后,ABL-M组与ABL-H组神经功能评分明显低于MCAO组(P<0.05);但ABL-L组与MCAO组比较无统计学差异(P>0.05)。2脑组织水含量:MCAO组明显高于sham组(P<0.05);ABL处理后,ABL-H组和ABL-M组脑组织含水量明显低于MCAO组(P<0.05),ABL-L组脑组织含水量与MCAO组差异无统计学意义(P>0.05)。3脑梗死体积:sham组表现为均匀一致的红色,MCAO组出现大范围苍白色梗死区域。ABL处理后,大、中、小三个剂量组苍白色梗死区域体积均缩小。4 ABL减轻了小鼠局灶性脑缺血损伤后的炎症反应:免疫组化结果显示,MCAO组可见许多深染、固缩核的TNF-α、IL-1β阳性细胞。ABL处理后,阳性细胞数均有减少。Western blotting结果显示,MCAO组TNF-α和IL-1β表达明显升高(P<0.05),而三种不同剂量的ABL均能降低TNF-α和IL-1β的表达(P<0.05),其中ABL-H组更为明显。q RT-PCR结果显示,MCAO组TNF-α和IL-1β表达明显升高(P<0.05),ABL处理后,TNF-α和IL-1βm RNA表达明显降低(P<0.05)。ELISA结果显示,与MCAO组相比,ABL-M处理组中TNF-α和IL-1β的含量显著下降(P<0.05)。而在细胞水平,BV2细胞被氧糖剥夺处理后,TNF-α、IL-1β表达明显升高(P<0.05)。ABL(100μmol/L)处理后,与单纯氧糖剥夺处理组相比,TNF-α、IL-1β表达明显下降(P<0.05)。5 ABL通过抑制TLR-4/NF-κB信号通路减轻炎症反应:免疫组化结果显示,MCAO组可见许多深染、固缩核的NF-κB和TLR-4阳性细胞。ABL处理后,各剂量组NF-κB和TLR-4阳性细胞数均有减少。Western blotting结果显示,MCAO组NF-κB和TLR-4水平明显升高(P<0.05),而I-κB和TAB2水平显著降低(P<0.05),My D88和SOCS1在MCAO24h水平无明显变化(P>0.05)。三种不同剂量的ABL均能降低NF-κB和TLR-4的水平(P<0.05),其中ABL-H组更为明显。相反,ABL呈剂量依赖地增加了炎症负性调节炎症因子I-κB、My D88和SOCS1的表达(P<0.05)。而在细胞水平Western blotting结果显示,BV2细胞被氧糖剥夺处理后,NF-κB和TLR-4水平明显升高(P<0.05)。ABL(100μmol/L)处理后,显著减少了NF-κB和TLR-4的水平(P<0.05),增加了I-κB、My D88、SOCS1水平。结论:ABL可显著改善局灶性脑缺血损伤后小鼠神经功能缺损,减轻脑水肿,减小梗死体积,起到神经保护作用;ABL通过抑制脑缺血引发的TLR4/NF-κB信号级联减少TNF-α、IL-1β的表达,同时通过上调TLR4/NF-κB途径中的负调节因子My D88和SOCS-1表达,发挥对脑缺血损伤的抗炎作用。第二部分mi R-155在缺血性脑组织中的表达及旋覆花内酯对mi R-155目的:观察mi R-155是否参与缺血脑组织的炎症反应,以及ABL是否通过调节mi R-155的表达来发挥抗炎作用。方法:实验1:选用成年雄性CD1小鼠,采用改良线栓法制备MCAO小鼠模型。将CD1小鼠随机分为5组:假手术组(sham)、模型组(MCAO)、ABL小剂量组(ABL-L)、ABL中剂量组(ABL-M)、ABL大剂量组(ABL-H)。将BV2小胶质细胞分为对照组(con)和氧糖剥夺处理组(OGD),再分为用ABL(100μmol/L)预处理24 h和不用ABL预处理组。用q RT-PCR和报告基因方法检测脑组织和BV2细胞中mi R-155的表达。实验2:选用8周龄雄性mi R-155基因敲除(mi R-155 KO)小鼠和野生型(wild-type,WT)小鼠,并向WT小鼠侧脑室注射p Ad-mi R-155(p Ad作为对照),以过表达mi R-155。采用改良线栓法制备MCAO小鼠模型。ABL处理组MCAO术前30 min,腹腔注射ABL(20mg/kg)。在BV2小胶质细胞中过表达或敲低mi R-155。腺病毒感染实验用于在BV2中过表达mi R-155;si RNA转染用于在BV2中敲低mi R-155。再分为ABL处理组(100μmol/L)和不用ABL处理组,氧糖剥夺处理24 h。脑缺血后24 h处死动物进行观察、检测。各组取材前进行神经功能评分、TTC染色评价梗死体积;应用Western blotting和q RT-PCR方法检测脑组织和细胞中TNF-α、IL-1β的表达。1缺血脑组织和OGD诱导的BV2细胞中mi R-155的表达:q RT-PCR结果显示,MCAO后24 h,与sham组相比,脑组织中mi R-155的表达显著升高(P<0.05),而ABL处理后,mi R-155表达显著减少,且呈剂量依赖性。BV2小胶质细胞经OGD处理4 h后mi R-155的表达显著升高(P<0.05);用ABL预处理24 h,mi R-155的表达则明显下降(P<0.05)。2神经功能评分:MCAO 24 h后,与WT组相比,mi R-155KO组的神经功能评分明显降低(P<0.05);而ABL处理不再继续降低神经功能评分(P>0.05)。3脑梗死体积:MCAO 24 h后,与WT组相比,mi R-155KO组苍白色梗死体积明显缩小(P<0.05);但ABL处理不再使梗死体积进一步减少(P>0.05)。4 ABL抑制mi R-155介导的炎症反应:Western blotting结果显示,梗死后,mi R-155 KO小鼠缺血脑组织中TNF-α和IL-1β的表达显著减少(P<0.05);ABL处理进一步减少了mi R-155 KO小鼠TNF-α和IL-1β的表达。在q RT-PCR结果中,我们观察到相似的变化。通过向WT小鼠侧脑室注射p Ad-mi R-155使mi R-155过表达后,则显著增高缺血脑组织中TNF-α和IL-1β的表达水平,两种炎症因子的上调可被ABL轻微抑制。q RT-PCR的结果与蛋白表达变化相一致。细胞水平显示,过表达mi R-155显著增加OGD诱导的BV2小胶质细胞的TNF-α和IL-1β表达(P<0.05)。敲低mi R-155则明显减低了TNF-α和IL-1β的水平(P<0.05),并且ABL处理能进一步减少这两种炎性因子的表达。结论:在缺血脑组织和OGD诱导的BV2细胞中,mi R-155表达显著增加,ABL抑制mi R-155的表达;mi R-155功能获得和缺失实验证实,mi R-155介导TNF-α和IL-1β的表达;ABL通过抑制mi R-155表达来下调TNF-α和IL-1β的水平,从而起到抑制炎症反应的作用。第三部分旋覆花内酯通过抑制mi R-155介导的炎症反应而发挥脑保护作用目的:揭示ABL调制mi R-155表达及其抗炎作用的分子机制。方法:选用8周龄雄性mi R-155基因敲除(mi R-155 KO)小鼠和野生型(wild-type,WT)小鼠,通过向WT小鼠侧脑室注射p Ad-mi R-155使mi R-155过表达。采用改良线栓法制备MCAO小鼠模型。MCAO前30min,ABL处理组向腹腔注射ABL(20 mg/kg)。在BV2细胞中过表达或敲低mi R-155,腺病毒感染实验用于在BV2细胞中过表达mi R-155,si RNA转染实验用于敲低mi R-155。再分为ABL处理组(100μmol/L)和不用ABL处理组两组。OGD处理24 h。脑缺血后24 h处死动物进行观察、检测。应用Western blotting和q RT-PCR方法检测脑组织和BV2细胞中TLR4、My D88和SOCS1的表达;用Western blotting检测Akt、ERK、JNK和NF-κB等炎症信号转导分子的磷酸化水平。1 ABL通过调制TLR4/My D88和SOCS1表达抑制mi R-155介导的炎症反应:Western blotting结果显示,WT小鼠MCAO后24 h,TLR4条带明显可见,而TLR4表达在mi R-155 KO小鼠中明显降低(P<0.05),同时,TLR4表达在mi R-155 KO小鼠中不再因ABL处理而进一步降低。mi R-155 KO小鼠中My D88和SOCS1的表达显著高于WT小鼠(P<0.05),ABL处理与否对其表达无明显影响。q RT-PCR得到类似的结果。mi R-155过表达小鼠的缺血脑组织中TLR4的表达显著增高(P<0.05);ABL能显著抑制TLR4的表达。相反,mi R-155过表达降低My D88和SOCS1的表达,ABL处理则上调其表达。我们进一步用BV2细胞对整体水平的实验结果进行验证,发现在OGD处理的BV2细胞中,mi R-155过表达促进TLR4,抑制My D88和SOCS1的表达。敲除mi R-155后,TLR4的表达下调,而My D88和SOCS1的表达增加。ABL孵育后,TLR4、My D88和SOCS1的表达变化与整体实验结果相一致。2 ABL不直接作用于炎症信号转导分子:在过表达mi R-155的小鼠,MCAO后缺血脑组织中p-Akt、p-ERK、p-JNK和p-NF-κB水平明显升高。相反,mi R-155敲除则使这些信号转导分子的磷酸化水平降低。说明mi R-155参与Akt、ERK、JNK和NF-κB的表达和/或激活。我们在BV2细胞水平上进一步证实了整体水平上的实验结果。ABL不明显影响Akt、p38、ERK、JNK和NF-κB的磷酸化。结论:ABL通过上调My D88和SOCS1表达对mi R-155介导的炎症反应发挥抑制作用;ABL通过阻抑mi R-155表达而间接调制炎症信号转导分子水平。ABL不直接激活炎症信号转导分子。