目的:研究华蟾毒精(Cinobufagin,CINO)对人肝癌细胞的抑制作用及其分子机制。方法:体外培养人肝癌细胞SK-Hep1,经CINO处理后,(1)通过CCK8、细胞克隆形成实验检测细胞的增殖情况;(2)并用流式细胞术分析CINO处理后SK-Hep1细胞的周期变化;(3)此外,经CINO处理后,运用蛋白免疫印迹实验(Western blot)分析周期相关蛋白(Cyclin d1、P27)、凋亡标志蛋白[剪切的PARP(c-PARP)、剪切的Caspase3(c-Caspase3)]、AKT/mTOR通路相关蛋白(p-AKT、p-P70S6k、p-S6)、DNA损伤标志蛋白γH2AX的表达情况、内质网应激中eIF2α通路相关蛋白(p-eIF2α、ATF4)、以及用PCR从mRNA水平分析内质网应激标志物XBP1的活化剪切情况;(4)进一步地,通过转染eIF2α-S51A质粒、si-eIF2αRNA后与CINO联用,经Western blot分析c-PARP及eIF2α通路相关蛋白的表达;(5)另外,用AKT/mTOR抑制剂LY294002或转染AKT活化质粒后,再经CINO刺激,通过Western blot分析c-PARP及AKT/mTOR通路相关蛋白的表达。结果:(1)CINO抑制人肝癌细胞SK-Hep1的增殖:CCK8、细胞克隆形成实验结果显示,SK-Hep1细胞经CINO处理后,其增殖能力明显降低。(2)CINO阻滞人肝癌细胞SK-Hep1的细胞周期:CINO处理后,流式细胞术检测结果发现肝癌细胞周期阻滞在G0/G1期。(3)CINO通过下调人肝癌细胞SK-Hep1 Cyclin d1和上调P27蛋白表达影响细胞周期:Western Blot实验检测细胞周期相关蛋白Cyclin d1、P27表达发现,与对照组相比,CINO处理后下调了Cyclin d1蛋白表达水平,上调了P27蛋白表达水平。(4)CINO诱导人肝癌细胞SK-Hep1凋亡:Western Blot实验检测凋亡标志蛋白c-PARP、c-Caspase3蛋白表达,与对照组相比,CINO处理后c-PARP、c-Caspase3蛋白表达水平增加。(5)CINO活化人肝癌细胞SK-Hep1中的eIF2α通路:Western Blot实验检测eIF2α通路相关蛋白表达,与对照组相比,CINO处理后p-eIF2α、ATF4的蛋白表达水平增加;与此同时,PCR检测XBP1的mRNA水平时发现,与阳性对照TUN组相比,CINO处理组没有出现XBP1的活化条带。(6)抑制eIF2α的磷酸化后减弱了CINO诱导的人肝癌细胞SK-Hep1凋亡:转染eIF2α-S51A质粒、si-eIF2αRNA后与CINO联用,Western blot分析发现与单独处理组相比,转染+CINO联用组c-PARP蛋白表达水平下调。(7)CINO抑制人肝癌细胞SK-Hep1中AKT/mTOR通路:Western Blot实验检测AKT/mTOR通路相关蛋白(p-AKT、p-P70S6K、p-S6)表达时发现,与对照组相比,CINO处理后AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平明显下调。(8)抑制AKT/mTOR通路增强CINO诱导的人肝癌细胞SK-Hep1凋亡:LY294002抑制AKT/mTOR通路后,再经CINO处理,Western Blot分析发现,与单独处理组相比,联用组c-PARP蛋白表达量明显升高。(9)活化AKT/mTOR通路可减弱CINO诱导人肝癌细胞SK-Hep1的凋亡:转染AKT活化质粒后,Western Blot分析发现,与单独处理组相比,AKT+CINO联用组c-PARP蛋白表达水平明显下调。(10)CINO诱导人肝癌细胞SK-Hep1发生DNA损伤:Western Blot实验检测DNA损伤标志蛋白γH2AX的表达发现,与对照组相比,CINO处理后γH2AX蛋白表达增加。结论:CINO通过调控Cyclin d1和P27蛋白的表达将人肝癌细胞SK-Hep1的细胞周期阻滞在G0/G1期,从而抑制了人肝癌细胞SK-Hep1的增殖;CINO可通过活化eIF2α/ATF4通路、抑制AKT/mTOR通路、诱导DNA损伤促使人肝癌细胞SK-Hep1调亡。