目的 肿瘤坏死因子（TNF_α）是一种具有广泛生物活性的细胞因子,由活化的巨噬细胞和淋巴细胞产生,在炎症反应、细胞免疫应答、肿瘤免疫和细胞凋亡中发挥关键作用。调解TNF_α的表达将对临床治疗由TNF_α参与所致的各种疾病的治疗提供新方法。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指双链RNA（double strains RNA,dsRNA）通过刺激目标基因的RNA降解而特异性抑制目标蛋白质表达的现象,这些双链RNA与目标基因的RNA具有相同的序列。在对植物、果蝇、线虫的研究中均实现特异的RNAi效应,而在哺乳动物的研究中发现长链dsRNA（>30nt）会激活细胞抗病毒防御系统,导致RNA转录子的非特异性降解,细胞丧失总体的蛋白合成功能,使dsRNA失去特异的RNAi能力。若在哺乳动物细胞中使用短链（21-23nt）的小片断双链RNA（small interference RNA,siRNA）则不会诱发这些抗病毒机制而可以成功介导基因特异性抑制。 本试验利用siRNA触发哺乳动物RNAi,依据冷泉港实验室提供的靶位点选择原则和Promega公司提供的筛选软件选取针对小鼠细胞因子TNF_α基因的一段靶序列,经BLAST筛选,排除同源性,采用Silentgene^TM U6盒RNA干扰系统,将针对靶序列的双链RNA片断的模板,经PCR扩增后控制于U6启动子和U6聚合酶终止子之下,用转染试剂将其转入原代培养的淋巴细胞中,使其可在细胞内精确转录成siRNA,同时利用GFP载体质粒检测转染效率,研究该小片断RNA对小鼠淋巴细胞TNF_α表达的影响,为RNA干扰的临床应用奠定实验室基础。 方法 一、动态观察淋巴细胞产生TNF_α的能力。 用LPS刺激原代培养的C₅₇BL/6小鼠脾淋巴细胞,ELISA方法检测