多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种复杂难治的、累及中枢神经系统的慢性的脱髓鞘性疾病,炎性细胞浸润、髓鞘脱失以及轴索损伤等为其主要病理特点。此病病程反复、病灶多发,严重影响患者劳动能力,是导致中青年神经残疾的重要原因之一。众多证据表明MS的发病机制为T淋巴细胞介导的主要针对自身髓鞘抗原产生的免疫应答反应。炎性T细胞活化后破坏血脑屏障进而侵犯中枢神经系统,攻击髓鞘,并且导致神经元轴突受损。中枢神经系统中自身免疫反应的产生可能与外周T细胞稳态改变所致的免疫耐受功能障碍有着密切的关系。目前多发性硬化的治疗主要仍以抗炎为主,而且仅在复发和缓解期有效。因此,开发新的治疗方法已成为多发性硬化症患者亟待解决的问题。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是国际公认的多发性硬化经典动物模型,广泛用于多发性硬化的基础研究,它是由先天免疫系统细胞和自身免疫性CD4+ T细胞介导的。EAE和MS在组织病理学和临床方面的相似性使得从EAE模型中获得的发现可以外推到MS患者。众多研究从EAE动物模型中发现骨髓特异性CD4+ T细胞、T辅助细胞Th1和Th17,均产生于外周淋巴器官,并在那里被激活,然后释放到外周血液循环中,经过血脑屏障进入中枢神经系统而发挥其致病功能。骨髓特异性CD4+ T细胞一旦进入中枢神经系统后,遇到特异性抗原便会被激活,触发大量血液循环中的单核/巨噬细胞以及中性粒细胞在中枢神经系统募集,形成中枢神经系统的炎症反应。骨髓源性抑制细胞（MDSCs）是一类具有功能多样性的、免疫系统来源的的异质性细胞群。MDSCs最重要的特征是对T细胞的抑制功能。在小鼠中的MDSCs通常是通过CD11b和Gr-1的共表达来识别的,所以在小鼠中的MDSCs被定义为CD11b+Gr-1+细胞。众多实验证据证实,MDSCs可减弱EAE的发病病程。MDSCs主要是利用诱导型一氧化氮合酶（NOS2）和精氨酸酶-1（Arginase-1）来控制炎性T细胞的反应。Th1细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）诱发NOS2,而Th2细胞因子（IL-4和IL-13等）则上调Arginase-1。早期就有研究发现MDSCs的免疫抑制功能与L-精氨酸的代谢有关。L-精氨酸是Arginase-1反应底物,Arginase-1催化L-精氨酸产生尿素和L-鸟氨酸。研究表明,活化后的MDSCs表达了高水平的Arginase-1,它可大量消耗L-精氨酸从而直接抑制了 CD4—+T细胞的功能。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）,是氧化还原反应中传递氢离子的关键辅酶,广泛参与细胞的物质代谢、能量合成、基因表达、DNA修复和老化等多种生理活动。在缺血、创伤等神经领域研究也证明NAD+是拥有多个靶点的神经保护剂,对多种疾病具有潜在的治疗价值。STAT6（The signal transducer and activator of transcription6）是调节MDSCs扩增的主要通路调控蛋白,而且STAT6是促进arginase-1分泌的重要因子。然而,目前STAT6对EAE中MDSCs的调控作用尚不清楚。SIRT1和STAT6的活化之间有明确的联系,SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性蛋白去乙酰化酶,能够催化多种蛋白底物上乙酰基的去除。其生理作用依赖于NAD+。本实验首先通过对多发性硬化患者活动期的外周血血清进行分析,发现Arginase-1活性的表达水平与正常对照组相比呈降低趋势。Arginase-1是MDSCs发挥对CD4+ T细胞的抑制功能非常重要的细胞因子。接下来我们从这个方向入手,使用NAD+对EAE小鼠进行药物干预,评估不同组别小鼠的发病情况并观察NAD+对EAE小鼠的抑炎作用和对髓鞘脱失病理改变的作用效果,着重探讨NAD+是否可以影响CD11b+Gr-1+源性MDSCs的数量和功能进而调节实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）病情的进展。并且,我们提出了 NAD+改善EAE的一种新的分子机制,即NAD+处理可能通过激活SIRT6表达的磷酸化从而诱导MDSCs减弱EAE的病程,对NAD+是否通过调节SIRT1/STAT6/Arginase-1通路来进一步保护EAE进行研究。第一部分多发性硬化临床患者活动期外周血中精氨酸酶-1表达的研究目的:使用ELISA法检测正常对照组及多发性硬化临床活动期患者组外周血中的Arginase-1的血清水平。阐述Arginase-1在MS临床患者活动期外周血中的表达及变化情况。方法:1.选取实验对象。选取2019年2月至2020年1月在河北医科大学第二医院神经内科住院的初发与复发的多发性硬化患者10例,诊断标准均符合2010年McDonald改版多发性硬化诊断标准。正常对照组10例,均来自河北医科大学第二医院体检中心,年龄与性别均与多发性硬化组相匹配。在患者急性活动期入院且未开始接受糖皮质激素或免疫抑制剂等任何治疗前采集患者的外周血标本。2.使用ELISA法检测正常对照组及多发性硬化组患者外周血中的Arginase-1的血清水平。3.所有的实验数据均是采用SPSS22.0软件进行分析,且计量资料以x ±s表示,两组数据均是采用t检验,符合P<0.05即认为差异有统计学意义。结果:实验结果显示,EAE组患者血清中的Arginase-1的表达量较正常对照组患者显著降低。第二部分 NAD+通过调节CD11b+Gr-1+源性MDSCs活性抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎的机制研究目的:使用NAD+对EAE小鼠进行药物干预,评估不同组别小鼠的发病情况并观察NAD+对EAE小鼠的抑炎作用和对髓鞘脱失病理改变的作用效果,着重探讨NAD+是否可以影响CD11b+Gr-1+源性MDSCs的数量和功能进而调节实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）病情的进展。方法:1.选取实验动物。选取6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠体重约20±2g,小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠饲养于室内温度在24±2℃、相对湿度在50%-60%的恒温恒湿的SPF级环境中,每日明暗环境各12小时。2.建立EAE动物模型。用生理盐水将MOG35-55多肽稀释成10mg/ml,加入等体积的完全弗氏佐剂（CFA）和一定量的结核菌素,充分混合乳化,最终使得结核杆菌H37Ra浓度为4mg/ml,然后于小鼠脊柱两旁分4个点分别于皮下注射0.1ml的乳剂,而后于免疫第Oh及第48h分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素（PTX）。3.评估小鼠神经功能评分,采用HE和LFB染色评估脊髓的病理学变化情况。4.采用流式细胞学分析和免疫荧光染色分析法确定各组小鼠脾脏组织中CD11b+Gr-1+源性MDSC的数量变化情况。5.使用免疫荧光双染色法观察脊髓和脾脏组织中CD1 1b和Arginase-1的表达量。6.采用ELISA法检测各组小鼠血清Th1和Th2的炎症因子水平及Arginase-1的表达量7.所有的实验数据均采用SPSS22.0软件进行分析,并且计量资料以x ±s表示,两组数据均采用t检验的方式,且P<0.05即认为差异有统计学意义。结果:1应用NAD+干预后,NAD+组较EAE组小鼠的发病率明显降低,NAD+组小鼠的神经功能缺损评分明显低于EAE组小鼠,并且NAD+干预能够显著推迟EAE小鼠的起病时间。2 NAD+干预能够降低髓鞘缺失、改善EAE小鼠的炎性反应并且减少炎症细胞数量。通过对小鼠发病高峰期的LFB染色病理切片观察,空白对照组的脊髓前索及侧索白质处髓鞘保存完好而且边缘整齐。而EAE小鼠的病理切片出现了点状或者片状的白色空泡的髓鞘缺失区域。而NAD+治疗组脊髓白质髓鞘脱失范围及程度与EAE组小鼠相比则显著减少。通过对发病高峰时期的小鼠进行HE染色以进行病理学评价,我们观察到EAE模型组小鼠脊髓腰膨大处病理组织切片呈现出弥漫性以淋巴细胞为主的炎性细胞,甚至出现“血管袖套”样病理表现。NAD+治疗组炎性细胞数量明显减少、浸润范围变小、浸润程度亦明显减轻。免疫组化及荧光染色的结果显示,EAE组小鼠脊髓内聚集了大量巨噬细胞,而正常对照组罕见有巨噬细胞聚集;EAE组小鼠脊髓内有大量CD4+ T淋巴细胞呈现,而正常对照组小鼠内很少CD4+T淋巴细胞出现。NAD+干预显著降低EAE模型小鼠巨噬细胞和CD4+ T淋巴细胞数量。3 NAD+干预能够诱导脾脏中CD11b+Gr-1+ MDSCs的表达。免疫荧光双染色分别检测EAE模型组NAD+组小鼠脾脏细胞内CD11b和Gr-1双阳性MDSCs细胞含量。实验结果显示,NAD+组CD11b+Gr-1+MDSCs数量明显高于EAE模型组。通过流式细胞学的方法分别检测EAE模型组NAD+组小鼠脾脏细胞内CD11b和Gr-1双阳性MDSCs细胞含量,结果显示NAD+组小鼠脾脏细胞内MDSCs CD11b和Gr-1双阳性比率较EAE模型组升高。4.NAD+干预能够增加脊髓和脾脏内Arginase-1的表达量。使用CD11b（MDSCs的表面标志物）和Arginase-1的免疫荧光双染色法分别检测各组小鼠脊髓和脾脏中Arginase-1的表达。结果显示,NAD+药物干预组小鼠脊髓中的Arginase-1的表达较EAE组显著提高,NAD+药物干预组小鼠脾细胞中的Arginase-1的表达较EAE组亦显著提高。5.使用ELISA法检测各组小鼠血清中的Th1炎症因子IFN-γ和Th2炎症因子IL-13,以及Arginase-1的血清水平。结果显示,NAD+药物干预组小鼠血清中的IFN-丫的表达量较EAE组有所降低;NAD+药物干预组小鼠血清中的IL-13的表达量较EAE组显著升高;NAD+药物干预组小鼠血清中的Arginase-1的表达量较EAE组显著升高。第三部分 NAD+通过激活SIRT1/STAT6/Aginase-1通路发挥对实验性自身免疫性脑脊髓炎的保护作用目的:使用MOG35₅5建立C57BL/6小鼠的EAE动物模型,用NAD+进行干预,采用Western blot方法检测小鼠SIRT1蛋白表达、STAT6磷酸化程度和Aginase-1蛋白的表达情况,进一步阐述NAD+治疗EAE的作用机制。方法:1.选取实验动物。选取6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠体重约20±2g,小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠饲养于室内温度在24±2℃、相对湿度在50%-60%的恒温恒湿的SPF级环境中,每日明暗环境各12小时。2.建立EAE动物模型。用生理盐水将MOG35-55多肽稀释成10mg/ml,加入等体积的完全弗氏佐剂（CFA）和一定量的结核菌素,充分混合乳化,最终使得结核杆菌H37Ra浓度为4mg/ml,然后于小鼠脊柱两旁分4个点分别于皮下注射0.1ml的乳剂,而后于免疫第Oh及第48h分两次腹腔注射0.5ml百日咳毒素（PTX）。3.用 Western blot 方法法检测 SIRT-1、p-STAT6、t-STAT6、Arginase-1的蛋白表达情况。4.所有的实验数据均采用SPSS22.0软件进行分析,并且计量资料以x ±s表示,两组数据均采用t检验的方式,且P<0.05即认为差异有统计学意义。结果:1.Western Blot法评估脊髓组织中SIRT1的表达。应用Western Blot方法检测EAE模型组、NAD+治疗组脊髓组织中SIRT1蛋白表达情况:在小鼠脊髓组织中NAD+治疗组较EAE组SIRT1表达显著增加。2.Western Blot方法评估脊髓组织中t-STAT6及p-STAT6的表达。应用Western Blot方法检测EAE模型组、NAD+治疗组脊髓组织中t-STAT6及p-STAT6蛋白表达情况:在小鼠脊髓组织中,NAD+治疗组较EAE模型组p-STAT6/t-STAT6蛋白表达量的比值显著增加。3.Western Blot法评估脊髓组织中Arginase-1的表达。应用Western Blot方法检测EAE模型组、NAD+治疗组脊髓组织中Arginase-1蛋白表达情况:在小鼠脊髓组织中,NAD+治疗组较EAE模型组Arginase-1表达显著增加。结论:1.通过对多发性硬化患者活动期的外周血血清进行分析,发现Arginase-1活性的表达水平与正常对照组相比呈降低趋势。为多发性硬化的治疗方法寻找新的思路。2.应用MOG 35-55成功建立EAE动物模型,给予NAD+干预后,EAE小鼠髓鞘缺失、EAE小鼠的炎性反应得到有效控制,并且炎症细胞数量显著减少。实验结果说明NAD+通过激活MDSCs促进Arginase-1分泌,导致免疫功能抑制血清中Th1细胞因子下降、Th2细胞因子升高,最终抑制了 EAE小鼠脊髓内T淋巴细胞和巨噬细胞聚集和炎症反应,从而对EAE小鼠起到保护作用。3.NAD+能够通过激活SIRT1/STAT6/Aginase-1信号通路从而调节免疫炎症反应达到保护EAE小鼠的作用。由此我们猜测使用NAD+激活SIRT1/STAT6/Aginase-1信号通路可能能够成为多发性硬化有效的治疗靶点,同时也为新的临床药物的研发开拓了新思路。