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目的:弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL）是最为常见的非霍奇金淋巴瘤,一线治疗R-CHOP方案（rituximab plus cyclophosphamide,doxorubicin,vincristine和prednisone）取得了较好的疗效,但仍约30%的患者出现复发或者耐药,随着研究的深入,复发难治的DLBCL较为常见的特征之一是淋巴瘤细胞出现c-MYC蛋白或BCL2蛋白表达上调。C-MYC蛋白和BCL2蛋白表达增高的机制有多种,如基因本身的异常,上游调控机制的异常和蛋白质降解机制的异常等,由于基因异常导致的c-MYC和BCL2过表达是最具有特征的原因,这类淋巴瘤被定义为“双打击淋巴瘤（DHL）”患者约占10%左右。2016年WHO将带有这种特征的DLBCL归类为“高级别B细胞淋巴瘤（HGB）伴MYC与BCL2易位”。这类淋巴瘤无论采用目前的一线R-CHOP方案还是强烈的二线方案效果都不理想,5年PFS和OS仅为20-30%。因此需要探索新的药物或治疗方案。MYC基因重排导致的过表达是这类淋巴瘤的重要特征,MYC基因产物c-MYC蛋白是维持肿瘤细胞生存增殖的重要转录因子,它对细胞周期、有丝分裂、线粒体功能、蛋白合成、细胞代谢等生物过程相关的诸多基因都具有调控作用,所以c-MYC蛋白是肿瘤治疗的潜在重要靶点,然而,c-MYC蛋白由于缺乏底物的连接位点和较短的半衰期,难以直接靶向,并不具备成药性,所以目前以MYC为治疗靶点的研究仍然停留在间接抑制的阶段,包括抑制c-MYC的转录、影响c-MYC与转录调节位点的结合、干扰c-MYC协同因子以及抑制c-MYC下游信号通路等方案,但目前没有相关的药物取得了临床疗效。因此,需要进一步探索靶向MYC的治疗方法。二氢乳清酸脱氢酶（Dihydroorotate dehydrogenase,DHODH）是催化嘧啶从头合成途径（de novo pyrimidine pathway）第四步的关键酶,也是唯一位于线粒体膜的嘧啶合成酶,偶联了细胞氧化磷酸化过程中具有重要作用的电子传递链（electron transport chain,ETC）,参与二氢乳清酸（dihydroorotic acid,DHO）还原成乳清酸（orotic acid,OA）的过程,为下游胸腺嘧啶和胞嘧啶的合成、糖原合成、磷脂代谢以及糖基化修饰过程提供UMP原料。近年来的研究证实DHODH的抑制可以对多种肿瘤产生抑制作用,伯基特淋巴瘤最主要的分子学特征是MYC基因重排导致MYC基因和蛋白的过表达,抑制DHODH可以下调c-MYC蛋白从而抑制伯基特淋巴瘤的生长。提示DHODH抑制剂是潜在治疗DHL的药物,值得进一步研究。BCL2蛋白是DHL生存另一个重要因子,是抗凋亡蛋白家族的重要成员之一。目前,BCL2抑制剂已经被FDA批准用于小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病（SLL/CLL）的治疗,在急性髓系白血病中也取得了一定的疗效,但是,其在侵袭性淋巴瘤中的疗效和安全性还需验证,且副作用值得关注。因此,联合靶向DHODH和BCL2的治疗方案可能为DHL的治疗提供新的思路,需要进一步研究。研究方法:1.选择细胞系并验证细胞背景:选择DB和SU-DHL4细胞作为高级别B细胞淋巴瘤的模型细胞,通过FISH方法检测MYC和BCL2基因重排的情况。2.研究DHODH抑制剂单药对细胞系的作用:选择Brequinar（BRQ）作为DHODH抑制剂,通过CCK8法检测不同剂量的BRQ对DB和SU-DHL4细胞活率的抑制并计算IC50值;确定BRQ浓度后,通过CCK8法证实尿嘧啶（uridine）的挽救作用。通过流式和Western-blot方法检测BRQ对DB和SU-DHL4细胞周期和凋亡和细胞内活性氧变化的影响;通过Western-blot方法检测BRQ对DB和SU-DHL4细胞内重要信号通路（PI3K/Akt和NF-κB通路）和重要蛋白（c-MYC、BCL2和BAX）的影响;通过PCR方法检测BRQ对MYC基因转录的影响。3.证实BRQ的靶向性:利用CRISPR技术对SU-DHL4细胞的DHODH基因进行敲减。由于DHODH是细胞生存依赖的基因,所以为了维持细胞生长,所有敲减后的细胞均培养于含有1000uM uridine的培养基中。通过Western-blot方法验证敲减效果和DHODH敲减后去掉uridine后c-MYC蛋白的变化情况;通过CCK8法检测DHODH敲减对SU-DHL4细胞活率的影响;通过流式检测DHODH敲减后SU-DHL4细胞周期、凋亡的变化情况。4.证实BCL2抑制剂和DHODH抑制剂具有协同抑制作用和机制:选择Venentoclax作为BCL2抑制剂,通过CCK8法检测不同浓度Venetoclax对DB和SU-DHL4细胞活率的抑制并计算IC50浓度,通过CCK8法检测不同浓度Venetoclax与BRQ联用下DB和SU-DHL4细胞活率的变化,并计算协同指数（CI）。最终确定后续协同实验中Venetoclax浓度为20 nM,BRQ浓度为500 nM。通过流式检测DB和SU-DHL4细胞在单药和双药联合作用下细胞周期、凋亡和活性氧的变化;通过Western-blot方法检测DB和SU-DHL4细胞在单药和双药联合作用下细胞内Venetoclax耐药蛋白MCL-1和BCL-XL,细胞重要生存蛋白c-MYC和BCL2和BAX,c-MYC稳定性调控激酶JAK2/STAT3蛋白的变化;通过PCR法证实DB和SU-DHL4细胞在单药和双药联合作用下MCL-1和MYC基因表达的变化;通过免疫共沉淀法检测单药和双药作用下DB和SU-DHL4细胞BCL2与BAX连接和BCL2与BIM连接的变化。5.进一步证实BCL2抑制剂和DHODH抑制剂协同机制:RNA-seq法检测SU-DHL4细胞在单药和双药联合作用下基因表达谱的变化,选择变化明显的基因做验证,通过Western-blot和PCR法检测DB和SU-DHL4细胞在单药和双药联合作用下核糖体生物合成通路相关基因和B细胞发育和转化的基因;通过流式检测DB和SU-DHL4细胞在单药和双药联合作用下B细胞发育相关蛋白的变化。结果:1.DB和SU-DHL4细胞遗传背景验证。1.1 DB和SU-DHL4细胞同时携带MYC和BCL2的易位。1.2 DB细胞携带突变型TP53,SU-DHL4细胞携带野生型TP53。2.DHODH抑制剂BRQ对DLBCL细胞功能学的影响。2.1 BRQ通过时间-效应和剂量-效应的方式抑制DB和SU-DHL4细胞的活率,DB细胞对BRQ相对不敏感,BRQ的抑制效果可以被uridine挽救。2.2 BRQ可以通过激活内源性途径诱导DB和SU-DHL4细胞凋亡,通过TP53非依赖的方式诱导DB和SU-DHL4细胞G1/S期阻滞。BRQ可以增加DB和SU-DHL4细胞内活性氧水平。BRQ在凋亡、周期和活性氧水平产生的变化都可以被uridine挽救。3.DHODH抑制剂对DLBCL细胞生存依赖蛋白和信号通路的影响3.1 BRQ可以明显下调c-MYC蛋白,但是DLBCL中重要的信号通路PI3K/Akt通过和NF-κB通路都没有被BRQ影响,BRQ对c-MYC蛋白的作用可以被uridine挽救。3.2 BRQ可以在转录水平抑制c-MYC基因的表达,这种作用也可以被uridine挽救。4.DHODH的敲减产生与DHODH抑制剂相似的效果。4.1 DHODH敲减可以对SU-DHL4细胞活率产生抑制,可以促进SU-DHL4细胞G1/S期阻滞,可以诱导SU-DHL4细胞凋亡。4.2 DHODH敲减的同时去掉uridine后可以对c-MYC蛋白产生抑制作用。5.BCL2抑制剂与DHODH抑制剂对DLBCL产生协同诱导凋亡的作用。5.1 Venetoclax可以对DB和SU-DHL4细胞活率产生抑制作用。5.2 Venetoclax与BRQ联用协同诱导DB和SU-DHL4细胞凋亡,在周期水平和活性氧水平Venetoclax与BRQ联用并没有协同作用。6.BCL2抑制剂与DHODH抑制剂联用通过互补的机制产生协同效果。6.1 Venetoclax抑制BCL2蛋白与BIM蛋白的连接,而BRQ却并没有这种作用;BRQ可以抑制MCL-1和c-MYC蛋白转录,而Venetoclax却产生相反的效果。6.2 DHODH的抑制剂可以下调核糖体生物合成途径、B细胞活化和转化相关等多种基因的表达,而Venetoclax对这些基因却无调变作用。结论:靶向DHODH可以对DHL产生抑制作用,DHODH可以成为高级别B细胞淋巴瘤伴MYC和BCL2基因易位的新治疗靶点;靶向DHODH和BCL2可以通过影响不同的途径以互补的方式对淋巴瘤细胞有协同诱导凋亡的作用,DHODH抑制剂与BCL2抑制剂联用可以为DHL治疗提供新的治疗思路。