研究背景:缺血性心律失常是临床常见、危害性较大的心律失常。目前临床应用的抗心律失常药物几乎全部是各种离子通道阻断剂,在发挥治疗心律失常效应的同时,很容易发生因某些离子电流的不适当阻断而出现的新的电活动紊乱,因而有可能同时存在一定的致心律失常的风险。内向整流钾电流(inward rectifier potassium current,IK1)是心肌最主要的背景外向电流,参与心肌静息膜电位(resting membrane potential,RMP)的维持和动作电位(action potential,AP)3期终末的复极。IK1的改变必将影响心肌RMP的稳定和AP的复极,从而对心肌的兴奋性和心律失常的发生产生深刻影响。大量的实验和临床研究表明,急性心肌缺血和慢性心肌梗死时发生的心律失常与IK1的下降有关。因此,我们设想,IK1的减弱可能参与了由缺血性心脏疾病引起的心律失常的发生。我们最近报道了zacopride是一个选择性的大鼠心室肌IK1通道激动剂,可以增强IK1电流,而对其余心室肌主要的离子通道和转运体电流均无显著影响,我们推测zacopride做为首个选择性激动心肌IK1通道的工具药,可以通过激动IK1/Kir2.1通道进而增大或恢复RMP而发挥抗缺血性心律失常作用。为了证实这一设想,本研究拟明确IK1激动剂zacopride对急性缺血和慢性心梗致心律失常的抑制作用;通过观测zacopride在缺氧条件下对大鼠心室肌细胞IK1电流、RMP、AP和延迟后除极(delayed after depolarizations,DADs)的作用,以分析其抗缺血性心律失常的电生理机制;通过观测zacopride对正常大鼠干预后IK1电流的变化以及对大鼠急性模拟缺血模型、慢性心梗模型心肌组织Kir2.1蛋白表达的影响,分析其抗缺血性心律失常的分子机制。目的:1.建立大鼠急性缺血性心律失常模型,观察ik1激动剂zacopride对急性缺血性心律失常的影响。2.建立离体低氧灌流系统,观察zacopride在缺氧条件下对大鼠心室肌细胞ik1电流、atp敏感钾电流(atp-sensitivepotassiumcurrent,ikatp)、rmp、ap、dads的影响,以及在缺氧条件下对中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell,chocell)转染kir2.x通道的影响。3.建立大鼠心肌细胞急性模拟缺血模型,观察zacopride对大鼠心室肌细胞ik1蛋白表达的影响。4.建立大鼠慢性缺血性心律失常模型,利用遥测心电图监测zacopride对清醒大鼠慢性缺血性心律失常的影响,对iso诱发的心律失常的影响及对慢性缺血心肌kir2.1蛋白表达的影响。方法:1.大鼠急性缺血性心律失常模型的制备、实验分组、观测指标造模方法:成年雄性sd大鼠,麻醉,开胸,记录心电图(electrocardiogram,ecg),结扎冠状动脉左心室前降支,分别于结扎前3分钟、结扎后3分钟及结扎后发生首次持续性室速或室颤(sustainedventriculartachycardiaorventricularfibrillation,susvt/vf)30秒时进行药物干预,观测药物干预至冠脉结扎后15分钟内ii导联ecg的变化。实验分组:首先按给药干预的时间点分成3组,即:冠脉结扎前3分钟、结扎后3分钟、结扎后首次susvt/vf30秒处理组。上述每组再按药物干预的种类和剂量分为:对照组、zac5.0μg/kg组、zac15μg/kg组、zac50μg/kg组、利多卡因(lidocaine,lidoc)组。观测指标:累计室性期前收缩(prematureventricularcontraction,pvc)次数,室速(ventriculartachycardia,vt)持续时间和发生率,室颤(ventricularfibrillation,vf)持续时间和发生率,冠脉结扎至发生首次susvt/vf的时间和首次susvt/vf的终止时间。2.缺氧条件下细胞膜电流和膜电位的记录采用胶原酶法急性分离大鼠左室心肌细胞,建立离体低氧灌流系统,维持测试细胞在测试期间氧分压低于50mmhg,应用全细胞膜片钳技术,在电压钳模式下记录ik1电流和ikatp电流;在电流钳模式下(全程用10μmol/lglibenclamide阻断ikatp)观测大鼠心室肌细胞rmp、ap和分别由缺氧或iso诱发的dads。3.大鼠心肌kir2.1、kir2.2、和kir2.3的异源表达和缺氧条件下膜电流的记录通过rt-pcr法获得大鼠心肌kir2.1、kir2.2和kir2.3基因,将上述基因插入质粒pegfp-n1,将其转染入cho细胞,建立离体低氧灌流系统(po2<50mmhg),应用全细胞膜片钳技术,在电压钳模式下观测缺氧条件下cho细胞的kir2.1、kir2.2、kir2.3电流。4.大鼠心肌细胞急性模拟缺血(simulatedischemia,si)模型的制备和实验分组造模方法:取3只健康成年雄性sd大鼠,采用胶原酶法急性分离左心室肌细胞,梯度复钙(ca2+终浓度1.8mmol/l)后用不同浓度zacopride进行干预,孵育后离心,在上清液上层滴加矿物油以隔绝空气,造成模拟缺血。实验分组:正常对照组、si组、zac0.3μmol/l组、zac1.0μmol/l组、zac3.0μmol/l组。观测指标:用westernblot方法检测不同组别大鼠心室肌细胞ik1蛋白表达。5.大鼠慢性缺血性心律失常模型的制备、实验分组、观测指标造模方法:成年雄性sd大鼠,麻醉,开胸,记录心电图,结扎冠状动脉左心室前降支,建立心梗(myocardialinfarction,mi)模型,并将心电发射子植入腹腔,将装有大鼠的鼠笼置于信号接收板上,动物苏醒后采用心电遥测记录系统收集数据,观察大鼠清醒状态下ecg的改变,每天24小时监测,连续4周。实验分组:mi组、mi+zac组、假手术(sham)组、sham+zac组。观测指标:(1)检测指标:每只大鼠24小时室上性期前收缩(superprematureventricularcontraction,spvc)次数、传导阻滞(conductionblock,cb)次数、pvc次数和vt持续时间,作为每只动物每实验日的数据,分组计算每一监测指标的平均值并进行组间比较。(2)iso诱发的遥测大鼠心律失常实验于遥测大鼠4周末处死前进行。全部不同组别的大鼠均给予iso1280μg/kg尾静脉注射,检测每只动物1小时内pvc发生次数和发生率,vt持续时间和发生率,vf持续时间和发生率,分组统计平均值并进行组间比较。(3)遥测大鼠4周末处死,用westernblot方法检测遥测大鼠心肌kir2.1蛋白的表达,观测不同组别的大鼠心肌组织kir2.1的蛋白表达。6.ik1电流长期变化的观测分为正常对照组和zac组,分别于给药前和给药后的1、2、3、4周末采用胶原酶法急性分离两组大鼠左室心肌细胞,应用全细胞膜片钳技术,在电压钳模式下记录ik1电流的变化。结果:1.zacopride对大鼠急性缺血性心律失常的抑制作用在5.0-50μg/kg的剂量范围内,zacopride可显著抑制心律失常的发生,呈剂量依赖性,15μg/kg为zacopride抗心律失常最大效应剂量。(1)冠脉结扎前3分钟药物干预与对照组比,zac(15μg/kg)组出现心律失常的时间由334.3±16.5s延长至465.5±23.2s;pvc次数由158±34降至50±7;vt持续时间和发生率由55.8±10.2s,100%降至0.6±0.6s,12.5%;vf持续时间和发生率由5.1±2.0s,62.5%降至0s,0%;其抗心律失常的效应与阳性对照药利多卡因相似(p>0.05)。(2)冠脉结扎后3分钟药物干预与对照组比,zac(15μg/kg)组出现心律失常的时间由335.6±11.8s延长至447.1±26.1s;pvc次数由105±18降至14±5;vt持续时间和发生率由51.9±12.3s,100%降至1.8±0.9s,37.5%;vf持续时间和发生率由4.4±1.7s,75.0%降至0s,0%;其抗心律失常的效应与阳性对照药利多卡因相似(p>0.05)。(3)冠脉结扎后首个susvt/vf30秒药物干预(1)各组冠脉结扎至出现首个susvt/vf的时间相比无统计学差别(p>0.05)。(2)与对照组比,zac(15μg/kg)组终止首次susvt/vf时间由129.8±54.5s降至27.5±5.5s,后续发生pvc的次数由110±21降至26±10,vt持续时间由191.4±55.4s降至51.9±10.9s,vf持续时间由30.1±11.0s降至0s,其抗心律失常的效应与阳性对照药利多卡因相似(p>0.05)。2.缺氧条件下zacopride对大鼠心肌细胞ik1电流、ikatp电流和rmp、ap、dads的影响(1)缺氧条件下ik1外向电流明显被抑制,从常氧时的2.4±0.2pa/pf(-60mv)减小到1.3±0.3pa/pf(-60mv),zacopride可剂量依赖性激动ik1,1μmol/l为其最大效应剂量,可使ik1电流恢复至接近常氧状态的水平2.3±0.1pa/pf(-60mv),外向电流平均增量为76.9%,1μmol/lbacl2可以逆转缺氧时zacopride对ik1的激动效应,外向电流衰减为1.5±0.2pa/pf(-60mv)。(2)缺氧条件下,钳制心肌细胞电位至+20mv,持续约15min时,ikatp被激活,缺氧30min时加入1μmol/lzacopride,对ikatp无明显影响,激活的ikatp可以被glibenclamide(10μmol/l)所阻断。(3)心肌细胞缺氧时,rmp明显减小(去极化),给予1μmol/lzacopride可使其恢复至接近常氧水平,而1μmol/lbacl2可以逆转zacopride对rmp的效应。(4)缺氧条件下,心肌细胞动作电位幅度(actionpotentialamplitude,apa)降低(从113.80±2.31至89.27±7.40),动作电位时程(actionpotentialduration,apd)明显延长(adp50从12.64±0.34ms至20.38±1.86ms;adp90从31.8±0.7ms至48.6±3.6ms),给予1μmol/lzacopride可以使apa、adp50和apd90恢复至接近常氧水平(109.20±4.14;13.60±0.17ms;33.8±1.1ms),1μmol/lbacl2可以逆转zacopride对apa和apd的效应。(5)zacopride可显著抑制缺氧及iso导致的dads的发生。在缺氧条件下,1μmol/lzacopride使其发生率由73.3%降至20.0%;由iso诱发的dads,1μmol/lzacopride使其发生率由66.6%降至13.3%。zacopride对两种dads模型的抑制作用均可被1μmol/lbacl2消除。3.缺氧条件下zacopride对异源表达的kir2.x电流的效应(1)缺氧条件下,cho细胞上表达的kir2.1外向电流明显被抑制,从7.6±0.3pa/pf(-60mv)到5.8±0.3pa/pf(-60mv)。zacopride可剂量依赖性激动kir2.1通道,100μmol/l为其最大效应剂量,可使其恢复至接近常氧水平7.4±0.3pa/pf(-60mv),外向电流平均增量为27.6%。(2)缺氧条件下,zacopride对kir2.2、kir2.3电流无显著作用。4.zacopride可上调急性模拟缺血心肌细胞ik1蛋白表达模拟缺血条件下,在0.3-3.0μmol/l的剂量范围内,zacopride可恢复甚至增加由模拟缺血造成的大鼠心室肌细胞ik1蛋白表达的下降,1μmol/l为其最大效应浓度。5.zacopride对清醒大鼠慢性缺血性心律失常的抑制zacopride显著减少了大鼠心梗后4周内室性心律失常和房室传导阻滞的发生,但对室上性心律失常无明显作用。(1)各组大鼠存活率没有显著的统计学差异(p>0.05)。(2)在心电遥测记录的4周期间,mi组大鼠心律失常的发生明显高于其他各组。mi组pvc、vt/vf在第一天及第四周增多特别明显,而mi+zac组pvc与vt/vf在四周内均稳定维持在与sham组相近的低水平。mi组cb在第1天和第2周明显增多,mi+zac组则在4周内始终稳定在较低水平。mi组spvc四周内呈持续增多趋势,mi+zac组在前3周亦呈相似的增多趋势。(3)与mi组比,mi+zac组每只大鼠每天spvc次数没有明显变化(p>0.05),cb次数、pvc次数及vt/vf持续时间均明显降低(p<0.05),分别由79±15降至36±7;461±137降至90±48;59±26s降至12±12s。6.zace抑制iso诱发的清醒慢性心梗模型大鼠心律失常在心电遥测动物实验末期处死前,尾静脉注射iso可诱发im组和sham组大鼠发生显著的心律失常,zacopride干预的两组pvc、vt、vf次数和发生率均显著降低(p<0.05),与mi组相比,zacopride干预组pvc次数和发生率由1073±172,100%降至44±29,25%,vt、vf持续时间和发生率分别由109.2±30.0,80%降至0,0%;21.8±13.4,40%降至0,0%。与sham组比,zacoprid干预组PVC次数和发生率由981±95,100%降至42±29,22.2%;VT持续时间和发生率由8.7±6.4,22.2%降至0,0%。7.zacoprid可恢复慢性心梗模型大鼠已下调的心室Kir2.1的蛋白表达与sham组相比,MI组心室Kir2.1的蛋白表达明显下降,而MI+Zac组,心室Kir2.1的蛋白表达上调,甚至超过sham组;sham+Zac组心室Kir2.1的蛋白表达增高更为明显(P<0.01)。8.zacoprid增强正常大鼠IK1电流zacoprid逐周增大正常大鼠心肌细胞IK1外向电流,3周后心室肌IK1外向电流明显增强,大于0周和相同时间点的对照组数值(P<0.01)。结论:1.特异性IK1激动剂zacopride对大鼠冠脉阻断后发生的急性(15分钟内)和慢性(4周内)缺血性心律失常均具有显著抑制作用。2.缺氧条件下,zacopride可通过激活大鼠心室肌细胞IK1而恢复细胞被去极化的RMP、缩短延长的APD、抑制DADs的发生,是其抑制缺血性心律失常的重要机制。3.在缺氧条件下,zacopride仅激动Kir2.1通道电流,而对Kir2.2和Kir2.3电流无明显影响,明确了缺氧条件下zacopride激动IK1是通过Kir2.1亚型介导,与我们前期报道的常氧条件下的结论是一致的。4.zacopride可显著上调大鼠急性和慢性缺血心肌组织IK1蛋白的表达。