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蓝藻(Cyanophyceae)又可称为蓝细菌,是一种古老的原核生物,适应环境能力极强,大量繁殖时会引起水华污染环境。鱼腥藻PCC7120是引起水华现象的最主要的藻种之一,其内存在着大量的毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin systerm,TAS)基因。毒素-抗毒素系统由两个具有重叠碱基序列的基因组成,毒素基因编码稳定的毒素蛋白,抗毒素基因编码不稳定的抗毒素蛋白,有研究表明,环境胁迫条件下,毒素蛋白作用于宿主细胞,导致其生长抑制或死亡。asr0757/alr0758位于鱼腥藻PCC7120的染色体上,经NCBI序列比对发现与大肠杆菌中的MazEF有较高的同源性,且具有相同遗传结构特征,预测asr0757/alr0758可能构成TAS,为研究asr0757/alr0758是否属于TAS并验证其生物学功能,本实验分为两大部分进行:1):根据NCBI上提供的asr0757和alr0758碱基序列设计特异性引物,经Touch-Down PCR扩增后回收目的片段,构建TA克隆,目的片段插入表达载体pET-30a后导入表达菌E.Coli BL21中构建重组表达载体pET-30a-asr0757,pET-30a-alr0758,IPTG诱导蛋白表达,优化表达条件并对表达产物进行western blot鉴定,结果表明:asr0757与alr0758在37℃诱导6h,均成功诱导表达出了目的蛋asr0757(13.5KD)和alr0758(17.9KD),抗毒素表达量较好,毒素蛋白alr0758表达量较少,通过设置诱导时间梯度和IPTG浓度梯度优化毒素基因表达条件,优化结果显示:毒素基因alr0758在28℃,IPTG浓度为0.4mM,诱导10h时有最大表达量,蛋白纯化与western blot结果显示:诱导蛋白为目的蛋白。2):构建含asr0757/alr0758的双启动子表达载体,选择性诱导基因表达,并验证了其表达产物对细菌生长的影响,结果显示:成功诱导表达出了目的蛋白asr0757(13.5KD)和alr0758(17.9KD),当单独诱导asr0757基因表达时,细菌生长状况不受影响,单独诱导alr0758表达时细菌生长明显受到抑制,同时诱导asr0757和alr0758基因时细菌生长恢复正常,说明asr0757和alr0758构成具有生物功能的MazEF家族系统基因对,具有抗毒性与毒性功能。目前只有少数细菌的染色体上的TAS基因对是验证过的,本文的创新点在于:首次对asr0757/alr0758进行系统化的分析鉴定,验证了其是属于II型毒素-抗毒素系统,其后首次构建双启动子表达载体,通过诱导产物对宿主细胞生长影响验证其毒性与抗毒性作用。本实验结果为鱼腥藻染色体上其它预测基因的研究打下了基础,创造较好的研究条件,同时对于完善TA系统理论,补充发展其分子机制具有重要的理论意义。