背景肝移植是目前治疗各种终末期肝病的最佳治疗手段。而移植术后急、慢性排斥反应、缺血再灌注损伤,与肝脏供体缺乏一起,成为了肝移植领域面临的主要挑战。诱导肝移植术后免疫耐受是避免移植肝脏失功及长期服用免疫抑制剂的最佳途径,也是近年移植领域研究的重点和热点。Kupffer细胞(KCs)作为肝脏的最大巨噬细胞群,在肝移植免疫中发挥着极其重要的作用,其机制与抗原提呈、不同表型下的免疫功能及调控T淋巴细胞免疫功能等密切相关。新近研究发现,T细胞免疫球蛋白粘蛋白4(T cell immunoglobulin domain and mucin domain,Tim-4)参与了Th2细胞分化、凋亡细胞吞噬清除、巨噬细胞功能调节等诸多免疫调控的重要环节。但目前为止有关Tim-4分子的研究主要集中在变态反应性疾病及自身免疫性疾病方面,尚未涉及肝移植免疫。因此,探索Tim-4对KCs免疫功能及在肝移植术后免疫调控中的作用及机制,可能为诱导肝移植术后免疫耐受提供新的思路和理论依据。第一部分Tim-4表达变化对Kupffer细胞免疫功能调控的作用研究目的通过抑制或上调KCs中Tim-4表达,观察Tim-4过表达及沉默状态下对KCs分泌Th1/Th2类细胞因子及抗原呈递作用的影响及相关机制。方法(1)非连续梯度离心法分离、培养BALB/c小鼠肝脏KCs,免疫荧光染色及台盼蓝染色判断细胞纯度及活率,吞墨实验判断其吞噬功能;(2)流式细胞仪及免疫组化检测KCs特异性表面分子CD163和CD68的表达来鉴定KCs;(3)鉴定后的KCs随机分为四组:Tim-4过表达组(Ad V-Tim4 group);过表达对照组(Ctrl-Ad V group);Tim-4抑制组(Tim-4 sh RNA group);抑制对照组(Ctrl-sh RNA group);分别转染Tim-4过表达、抑制及相应错义序列慢病毒获得稳定封闭的细胞群。以LPS(终浓度100ng/m L)活化KCs后作KCs免疫功能相关检测;(4)免疫荧光及共聚焦显微镜检测评估Tim-4相关慢病毒转染效率;(5)ELISA检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β表达水平;(6)Western Blot及RT-PCR检测各组KCs中Tim-4、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β蛋白和基因表达水平;(7)流式细胞术(FCM)检测各组KCs的表型分子表达情况;(8)分离BALB/c小鼠脾细胞悬液,制备纯化T细胞,FCM检测纯度,与上述各组KCs共培养,MTT法检测T细胞增殖情况;Annexin V/PI法观察T淋巴细胞凋亡情况;(10)ELISA检测T细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β等细胞因子含量;(11)Western-blot测定KCs中LPS/TLR4/NF-κB及MAPK通路关键蛋白p65、p38、ERK1/2、JNK、IRF3及其磷酸化蛋白表达水平。结果(1)KCs细胞表面特异性分子表达呈阳性,台盼蓝染色提示KCs活力>90%,吞墨实验证实其具有良好的吞噬能力;(2)转染Tim-4慢病毒后,6h开始KCs即出现荧光表达,48h前后达到高峰;Western Blot检测结果显示:Ad V-Tim4组中Tim-4蛋白水平显著高于对照组(1.90±0.41 vs.1.13±0.32,P<0.05);而Tim-4 sh RNA组中Tim-4的蛋白表达水平与其对照组相比较显著降低(0.52±0.11 vs.1.3±0.31,P<0.05);(3)FCM检测活化的KCs表面共刺激发现:Ad V-Tim4中MHC-II、CD80、CD86、CD40的表达明显低于对照组,而M2型分子CD204和CD206的表达则高于对照组;而在Tim-4 sh RNA组中,以上分子的表达则呈相反趋势;(4)ELISA检测各组KCs培养液中细胞因子发现:在Ad V-Tim4组,TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表达与其对照组比较明显降低(P<0.05),而IL-10、TGF-β水平较对照组表达增高;在Tim-4抑制组,TNF-α、IL-1β、IFN-γ的表达较其对照组增高,而IL-10、TGF-β的表达量则呈相反趋势(P<0.05);同时,Western Blot证实KCs中上述细胞因子的蛋白水平变化与ELISA结果一致。(5)Western Blot检测发现:Ad V-Tim4组中KCs内Ikkα,IκBα,NF-κB p65,ERKl/2、p38和IRF3的蛋白表达及其磷酸化水平均受到抑制,JNK蛋白表达无显著变化;而在Tim-4 sh RNA中,上述蛋白的磷酸化表达有所增强;(5)T细胞与各组KCs共培养72h后,MTT结果表明:Ad V-Tim4组T淋巴细胞的增殖较对照组受到抑制(0.43±0.04 vs.0.72±0.05,P<0.05);而Tim-4 sh RNA组中T淋巴细胞增殖有所增强(0.92±0.07 vs.0.69±0.06,P<0.05);(6)FCM检测发现Ad V-Tim4组中T淋巴细胞凋亡明显增加(38.42%±7.36%),而抑制Tim-4后T淋巴细胞凋亡率显著下降(13.98%±4.59%);(7)ELISA检测发现:Ad V-Tim4组与T细胞培养液中促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ)分泌减少,抗炎细胞因子(IL-10)分泌增加(P<0.05),而Tim-4抑制组呈相反趋势。结论(1)过表达Tim-4可调控活化的KCs分泌谱改变,其机制可能与Tim-4抑制了LPS/TLR4/NF-k B、LPS/MAPK及IRF3通路活性有关;(2)过表达KCs中Tim-4可抑制KCs表面共刺激分子(MHC-II、CD80、CD86、CD40等)的表达,同时M2型KCs表型分子表达增加;(3)过表达Tim-4能有效抑制KCs的抗原提呈功能,抑制T淋巴细胞的增殖及促进活化T细胞凋亡。第二部分KCs中Tim-4表达变化在小鼠肝移植免疫耐受诱导的作用研究目的经门静脉灌注供肝转染过表达Tim-4或Tim-4-sh RNA慢病毒,观察增强或抑制KCs中Tim-4表达对肝移植后Ac R程度的影响,并探讨其相关机制。方法(1)采用改良“双袖套”法建立BALB/c→C3H小鼠肝移植急性排斥反应模型;(2)受体随机分为三组(n=30只/组):Tim-4过表达组(Ad V-Tim4 group);Tim-4抑制组(Tim-4 sh RNA group);错义序列对照组(control group)。分别于供肝血管吻合完成后经门静脉高压注射携带Tim-4的慢病毒感染供肝;(3)每组取10只动物观察各组术后生存时间及生存率,其余受体于术后7d获取组织及血液标本;(4)ELISA法检测血液中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10及TGF-β含量,Real-time PCR检测肝组织中上述细胞因子的m RNA表达水平,全自动生化仪检测转氨酶及胆红素水平;(5)Western-blot测定肝脏KCs中Tim-4、p65、p38、ERK1/2、JNK、IRF3及其磷酸化蛋白表达水平;(6)获取光、电镜标本观察病理形态变化;免疫组织化学染色及激光共聚焦观察各组移植物中CD4+T细胞和KCs的浸润情况;TUNEL检测移植区T细胞凋亡情况;透射电镜和激光共聚焦显微镜判断KCs吞噬凋亡细胞情况。结果(1)术后第7天,Ad V-Tim4组受体生存率以及肝功能较其余两组得到明显的改善(P<0.05);(2)HE染色表明Ad V-Tim4组RAI评分属轻度排斥反应,其余两组则呈重度排斥反应;(3)PCR结果发现,细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ的m RNA水平在Ad V-Tim4组低表达,而IL-10呈高表达(P<0.05);外周血ELISA检测结果与PCR结果一致;(4)Western-blot检测到Ad V-Tim4组肝脏KCs中Tim-4表达较Control组和Tim4-sh RNA组增高(P<0.05),但p65、p38、ERK1/2、JNK和IRF3的磷酸化蛋白表达水平更低(P<0.05);(5)TUNEL显示Ad V-Tim4组汇管区淋巴细胞凋亡率远高于Control组和Tim4-sh RNA组;(6)免疫组化、激光共聚焦结果提示:与对照组相比,CD4+T细胞及活化KCs在Ad V-Tim4组浸润减少,而在Tim4-sh RNA组显著增加;(7)激光共聚焦显示KCs在Ad V-Tim4组吞噬凋亡细胞显著增多,而Tim4-sh RNA组KCs吞噬明显减少。结论(1)在受体内上调KCs中Tim-4表达能显著减轻肝移植后Ac R对肝脏组织的损伤程度并诱导免疫耐受形成;(2)其机制可能与Tim-4抑制KCs内LPS/TLR4/NF-k B、LPS/MAPK及IRF3等信号通路活性、减少促炎细胞因子分泌、减少移植肝脏内CD4+T细胞局部浸润并促进其凋亡、同时促进KCs对凋亡细胞的吞噬清除等因素有关。