小麦纹枯病菌胞壁降解酶的致病作用及PG的分离纯化与理化特性

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纹枯病(Rhizoctonia cerealis)是导致我国乃至世界小麦减产的重要病害。为了深入阐明小麦纹枯病菌的致病机理,特别是多聚半乳糖醛酸酶(PG)等胞壁降解酶在致病过程中的作用,为病害防治提供新的理论依据及有效手段,本文对病菌产生的胞壁降解酶种类及其致病作用进行了初步研究,同时首次分离、纯化出病菌的一种PG,并明确其组成和理化性质。试验结果如下:将病菌菌丝块移至改良的Marcus培养液中22℃下培养6d,经抽滤除去菌丝,和离心(4℃、8000rpm,10min)去除沉淀,获上清即粗酶液。通过测定,病菌能产生多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、纤维素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸转移消除酶(PGTE)和果胶甲基转移消除酶(PMTE)等5种胞壁降解酶,其中,PG活性最高,酶活达722.22U/mL;其次是PMG和Cx,酶活分别为444.44U/mL和245.79U/mL;而PGTE和PMTE活性很低。另外,在小麦叶鞘病斑组织中,PG、PMG和Cx三种酶的活性均极显著高于PGTE和PMTE;不同病斑部位中,褪绿部(病斑最外侧)酶活最高;其次是褐色部;而枯白部(病斑中央)酶活较低。这表明在病菌侵染和破坏寄主植物的初期,PG、PMG和Cx等胞壁降解酶发挥着重要作用。针刺接种表明,病菌PG、Cx及其混合酶液(1:1)可破坏小麦叶鞘组织,引起一定病状,如黄化,出现水渍状病斑。另外,PG、Cx及其混合酶液对小麦叶鞘细胞膜有显著的损伤作用,即改变细胞膜透性,导致还原糖量增高。通过丙酮沉淀和离心(4℃、8000r/min,15min),从病菌培养滤液中提取PG粗蛋白。将PG粗蛋白依次经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析Phenyl-Sepharose6Fast Flow疏水层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析,获得具有较高活性的PG纯化蛋白。SDS-PAGE和IEF-PAGE电泳表明,PG蛋白分子量为41.78kD,等电点为5.34。经初步组成分析,PG含有糖基,含糖量为9.1%,不含脂类物质,是一种糖蛋白;其蛋白部分含有α-氨基酸,不含芳香族氨基酸。另外,PG在pH4-12范围内均有活性,pH6时活性最大;对高温(≥40℃)不稳定,100℃水浴20min活性完全丧失;对紫外线、氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K都非常敏感,处理后活性分别下降81.4%、85.1%、84.3%和89.8%。
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