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猪伪狂犬病(Pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起的以家畜和多种野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性、热性传染病。该病在猪群多呈暴发流行,给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失,目前尚无治疗PR的有效药物,因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。本研究以实验室分离株PRV-JSZ株为材料,通过Cre-loxP系统构建了不带标记基因的gE单缺失株及gE/TK双缺失株,对重组伪狂犬病病毒的生长特性及免疫保护力进行了初步研究,为研制猪伪狂犬病疫苗及病毒载体疫苗提供了技术平台。1伪狂犬病毒gE单缺失株及gE/TK双缺失株的构建以PRV-JSZ株基因组DNA为模板,分别扩增出gE基因、TK基因两侧的序列作为重组臂,以绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记,分别构建了带有loxP位点的pSKgERL-GFP、 pSKTKRL-GFP转移载体。蛋白酶K消化和苯酚抽提法提取PRV-JSZ株感染的PK15细胞总DNA,运用磷酸钙沉淀法,将细胞总DNA和转移载体pSKgERL-GFP以10μg:1μg的量共转染PK15细胞,待出现80%细胞病变时收获病毒,倍比稀释后接种单层PK15细胞,以空斑纯化法得到带有EGFP的重组病毒rPRV-gE-/GFP。取10μgrPRV-gE-/GFP基因组DNA,加入2.5单位Cre重组酶,37℃作用1h；抽提DNA,制备磷酸钙-DNA沉淀物,转染PK15细胞,空斑纯化得到剔除EGFP的gE单缺失株rPRV-gE-.基因组PCR产物序列分析显示rPRV-gE在gE基因内部缺失883bp。将rPRV-gE基因组DNA和转移载体pSKTKRL-GFP共转染PK15细胞,待出现80%细胞病变时收获病毒,荧光筛选得到重组病毒rPRV-gE-/T-/GFP,将Cre重组酶处理的rPRV-g-/TK-/GFP基因组DNA转染PK15细胞,筛选获得了剔除EGFP的gE/TK双缺失株rPRV-g-/TK-。基因组PCR产物序列分析显示rPRV-gE/TK在TK基因内部缺失498bp。2缺失株生长特性及免疫效力的研究对gE单缺失株及gE/TK双缺失株生长特性及免疫效力的研究发现,PRV-JSZ、rPRV-gE-和rPRV-gE/TK在PK15细胞上的最高滴度分别为10-4932TCID50/0.1mL、10-4.944TCID50/0.1mL和10-4444TCID50/0.1mL,与野生株相比,gE基因的缺失对病毒增殖无明显影响,而gE和TK基因的双缺失对病毒的增殖有一定影响。PRV-JSZ、rPRV-gE-.和rPRV-gE-/TK对小鼠的LD50分别为3.16×103TCID50、5.01×104TCID50和>1×105TCID50,结果表明,与野生株比较,gE单缺失株对小鼠的毒力有所降低,gE/TK双缺失株则表现出毒力的显著降低。以104TCID50免疫小鼠,利用ELISA方法检测血清中的抗PRV抗体,rPRV-gE-/TK-免疫组在免疫后21d可检测到血清抗体,平均OD值达到1.787±0.279,而rPRV-gE免疫组在免疫后始终检测不到血清抗体；用PRV-JSZ株攻毒后,两株缺失株对小鼠产生了相同的保护效果,保护率均为80%。上述结果表明,rPRV-gE-/TK安全性好,对PRV强毒的攻击有保护作用。