飞蝗(Locusta migratoria),属于直翅目(Orthoptera),蝗总科(Locust),因其可以随风迁飞,遍布非洲、东印度群岛以及我国的大部分地区等,主要为害小麦、高粱、玉米等农作物,严重影响中国乃至世界的农牧业生产。飞蝗属于渐变态昆虫,变态与蜕皮相伴发生,在昆虫整个生命过程中,正常的蜕皮对其至关重要。昆虫蜕皮受两种重要激素的调节,即保幼激素(JH)与蜕皮激素(20E),因此参与20E合成的Halloween基因受到科学家的广泛关注,同时Halloween基因是一种潜在的害虫防治靶标。本研究首先通过分子克隆,获得飞蝗6个Halloween基因LmNvd、LmSpookier、LmPhantom、LmDisembodied、LmShadow与Lmshade的cDNA全长,其次采用RT-qPCR技术揭示飞蝗6个Halloween基因时空表达谱。最后通过RNAi技术研究飞蝗6个Halloween基因对飞蝗若虫发育的影响,主要研究内容如下:一、飞蝗LmNvd的分子特性及其功能分析搜索飞蝗转录组与基因组数据库,获得LmNvd的cDNA序列,其开放阅读框序列为1,311bp,编码436个氨基酸,具有[2Fe-2S]Rieske型结构域与非血红素Fe(II)结合基序保守结构域,属于铁硫蛋白家族成员。RT-qPCR结果显示,LmNvd在前胸腺中表达丰度最高,并在五龄第七天前胸腺中表达水平最高。为了探讨LmNvd对飞蝗若虫发育的影响,利用RNAi向若虫注射LmNvd的dsRNA(dsLmNvd),以注射同等剂量GFP的dsRNA(dsGFP)的若虫为对照,相同环境进行饲养,结果显示,沉默LmNvd,若虫出现明显的蜕皮延迟、蜕皮失败与翅芽形态缺陷,而注射外源20E或7-脱氧胆固醇(7-DC)能够对异常表型进行拯救,H&E结果显示与ds LmNvd组相比,dsLmNvd+20E组若虫皮层溶离提前。最后利用RT-qPCR技术检测蜕皮相关基因的应答,结果显示沉默LmNvd 48 h后,LmE75(蜕皮激素信号通路基因)与LmCHT5(几丁质代谢基因)的表达量显著下调,而LmCHS1(几丁质合成基因)的表达量极显著上调。总之,LmNvd可通过调控20E的合成影响昆虫蜕皮过程与翅芽发育。LmNvd为20E合成途径的上游基因,沉默LmNvd导致若虫发育异常,因此其下游基因LmSpookier、LmPhantom、LmDisembodied、LmShadow与Lmshade的功能也值得进一步研究。二、飞蝗5个Halloween基因的鉴定及LmSpookier的功能分析搜索飞蝗转录组与基因组数据库,获得LmSpookier、LmPhantom、LmDisembodied、LmShadow与Lmshade的cDNA全长,其ORFs分别为1,578 bp、1,470 bp、1,581 bp、1,461 bp与1,605 bp,分别编码525、489、526、486与534个氨基酸,含有典型的CYP450保守基序,全部属于CYP450家族成员。聚类分析表明,飞蝗5个Halloween基因均能与代表性昆虫相应的Halloween基因聚为一支,飞蝗五龄若虫组织表达特性结果显示,LmShade在外周组织卵巢中表达水平较高,其余4个基因均在前胸腺中表达丰度最高。五龄若虫不同天数发育表达谱显示,飞蝗5个Halloween基因均在五龄第五天至第七天前胸腺存在高水平表达,而蜕皮激素的滴度在五龄第六天也出现峰值,这与Halloween基因的表达特性一致,暗示其可能参与对20E滴度的调控。利用RNAi技术探究飞蝗5个Halloween基因的功能,综合分析沉默效率及其对若虫发育的影响程度,沉默LmSpookier引起更为明显的蜕皮延迟、蜕皮失败与翅发育缺陷,而注射外源20E,能够拯救因注射LmSpookier导致的发育缺陷,对体壁显微结构皮层溶离的观察,也验证了这一结论。最后沉默LmSpookier 48 h后,检测蜕皮相关基因的表达,结果显示几丁质合成基因LmCHS1的转录水平显著上调,而几丁质代谢基因LmCHT5与LmCHT10的表达量显著下调。综上所述,LmSpookier通过调控20E的合成,进而影响昆虫蜕皮与翅芽发育。