鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是发生于鼻炎粘膜的恶性肿瘤,在东南亚及中国华南地区尤其高发,其发病率可达到25-50/10万。鼻咽癌的发病同EBV病毒感染、遗传易感性以及接触某些化学致癌物密切相关。尽管鼻咽癌的治疗手段不断更新和改进,但患者的5年生存率并没有得到明显的提高,其重要原因之一在于鼻咽癌的早期转移。一旦临床上出现颈淋巴结转移,患者五年生存率往往小于50%,如果出现远处转移,5年生存率则仅为20%左右。发现鼻咽癌侵袭转移的关键分子,阐明鼻咽癌侵袭转移的分子机制,采取有效的干预措施控制临床转移是鼻咽癌研究的重点。EB病毒(Epstein-BarrVirus,EBV)是一种特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒,95%以上的未分化型非角化性人类鼻咽癌组织中均可检出该病毒的感染。因此,EBV在鼻咽癌发生发展中的作用机制一直是鼻咽癌研究的重点,也是人们寻找鼻咽癌早期诊断、治疗新方法和判断预后的突破点。尽管研究者们从不同层面探索着EB病毒尤其是其潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A与鼻咽癌发生发展的关系,但是目前已有的研究数据仍不足以全面地揭示EB病毒在鼻咽癌侵袭转移中的作用。有文献统计报道,LMP1和LMP2A可在90%以上的鼻咽癌组织中检测到表达,LMP1阳性表达的鼻咽癌患者只有66.75%的转移率,LMP1不表达的鼻咽癌患者中,仍有46.98%患者出现转移。这些数据提示,除了 LMP1和LMP2A等调控机制外,EB病毒还有可能通过其他机制,调控鼻咽癌的侵袭和转移。众所周知,非编码微小RNA(microRNA或miRNA)是一类重要的基因表达调控因子,可在转录后水平或翻译水平调节基因表达,进而在细胞分化、组织凋亡,生物体发育及疾病(包括恶性肿瘤)发生发展过程中发挥着重要作用。目前已经发现病毒编码的miRNAs与人类miRNAs有着非常类似的生物学加工方式和诱导沉默复合物的功能,可以通过调控自身基因和宿主基因的表达水平,在病毒逃逸和潜伏感染等过程中发挥重要作用。EB病毒是第一个被发现能编码miRNA的病毒。2004年,Pfeffer等首次在EB病毒中分离出小RNA属人疱疹病毒家族成员,经研究表明其在病毒感染宿主过程中发挥作用,他们将这些miRNAs 分别命名为 EBV-miR-BHRF1-1、EBV-miR-BHRF1-2、EBV-miR-BHRF1-3、EBV-miR-BART1和EBV-miR-BART2,这是最早发现的病毒编码的miRNA分子。随后一年,Pfeffer等经过计算分析与实验研究又从29种病毒中识别出33条病毒miRNA。Pfeffer等人的发现使病毒miRNA研究成为一个新的研究热点,开辟了新的研究领域分支,为病毒miRNA分子调控宿主基因表达和病毒自身基因表达提供了新的研究方向,也向病毒与宿主细胞间相互作用新模式的研究迈出了重要的一步。目前,人们所鉴定出的能编码miRNA的病毒绝大多数属致瘤病毒,因此,可以推测病毒miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。病毒致瘤新学说认为:病毒miRNA分子能与宿主细胞中一些肿瘤和免疫相关基因的序列结合,如EB病毒miR-BHRF1具有与肿瘤抑制基因P53结合的潜在位点和与细胞凋亡调节因子Bcl-2mRNA3’端非编码区(3’ UTR)的结合位点,从而可能参与调控宿主细胞凋亡和细胞增殖,导致宿主抑癌基因功能的丧失和免疫监视功能的失常,最终引起肿瘤的发生;EBV-miR-BART5能与宿主细胞的PUMA基因结合,抑制细胞凋亡。另外,在调节自身基因方面,人们已预测和研究发现EB病毒miR-BART2是来自其DNA聚合酶(BALF5)转录本反义链,具有与BALF5 3’ UTR完全互补的序列,由此指导BALF5 mRNA降解和调控BALF5表达,导致宿主处于隐性感染状态。此外,miR-BART2可与BMLF1(EB2)_mRNA 3’UTR,miR-BART1可与BBLF4和LMP2A mRNA的3’UTR结合,达到调节病毒自身基因表达的目的。然而,目前大多数的相关研究仍局限于EB病毒miRNA在鼻咽癌中的表达谱分析和部分靶基因鉴定与初步功能分析,EB病毒miRNA在鼻咽癌发生发展尤其是在侵袭转移过程中的生物学作用和调控机制是一个有待探索的新课题。1.人鼻咽癌和慢性鼻炎组织的miRNAs表达谱芯片分析及荧光定量PCR验证miRNA芯片表达谱能够发现差异表达的miRNAs分子,给肿瘤早期诊断和治疗带来新的希望。为了深入探讨miRNAs在鼻咽癌的恶性进展和转移机理,寻找抑制鼻咽癌早期转移的标志分子,我们运用miRNA芯片分析技术对20例人鼻咽癌组织(NPC)和20例人慢性鼻咽炎组织(CNP)进行了 miRNA差异表达谱分析,发现70个差异表达显著的miRNAs(universal test;P<0.005;FDR<0.05;表达差异21.5倍),其中在NPC组织中表达下调的miRNA有46个,NPC组中表达上调的miRNA有24个。值得注意的是,24个表达上调的miRNA中,有 15 个是 EBV-miR-BARTs(占 62.5%),其中 EBV-miR-BART1、EBV-miR-BART7、EB V-miR-B ART3、EBV-miR-BART10、EBV-miR-BART8、EBV-miR-BART9和EBV-miR-BART5在NPC组织中表达上调7.8倍以上,EBV-miR-BART1上调倍数高达19.27倍。由于高通量表达谱芯片结果可能存在假阳性或假阴性,因此我们进一步采用Taqman Real-time PCR技术,以20对进行miRNA芯片的鼻咽癌组织和慢性鼻炎组织为研究对象,选择性对一些差异表达EBV-miR-BARTs(EBV-miR-BART1-5p、EBV-miR-BART1-3p、EBV-miR-BART3、EBV-miR-BART10、EBV-miR-BART8)和 Hsa-miRNAs(hsa-miR26a、hsa-miR-29c、hsa-miR660)进行验证,发现这些 EBV-miR-BARTs 和 hsa-miRNAs在NPC组织和CNP组织中差异表达均有统计学差异(t-test,P<0.05)。这些结果表明我们的miRNA表达谱芯片分析结果是可信的。鉴于EBV-miR-BART1在鼻咽癌组织高度表达,而且其在鼻咽癌发生发展中的作用及调控机制的研究迄今尚未见报道,我们将重点围绕该病毒编码的miRNA展开研究。2.差异表达EBV-miR-BART1在鼻咽癌发生、发展中作用我们首先开展临床样本和细胞生物学分析,探讨EBV-mIR-BART1在鼻咽癌发生发展中的潜在作用,并进一步验证miRNA表达谱芯片数据结果的可靠性。我们应用Taqman Real-time PCR检测另外收集的27例鼻咽癌组织和12例慢性鼻炎组织标本,证实EBV-miR-BART1两个成熟体(EBV-miR-BART1-5p和EBV-miR-BART1-3p)在鼻咽癌组织中表达均显著上调(t=-3.749,P<0.001;t=-4.094,P<0.001),而且与鼻咽癌患者的淋巴结转移和临床分期密切相关(P<0.05)。为了进一步验证临床分析数据,研究EBV-miR-BART1在鼻咽癌转移中的作用,我们采用慢病毒过表达miRNA与miRNA inhibitor沉默miRNAs策略,将表达 EBV-miR-BART1 前体(pre-EBV-miR-BART1)的慢病毒分别感染 CNE1,5-8F细胞株(EBV阴性的鼻咽癌细胞株),构建EBV-miR-BART1稳定过表达的鼻咽癌细胞株CNE1-BART1、5-8F-BART1,分析EBV-miR-BART1过表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。平板克隆形成实验检测EBV-miR-BART1过表达对鼻咽癌细胞克隆形成能力的影响。结果发现,EBV-miR-BART1过表达使CNE1细胞和5-8F细胞的克隆形成率分别增高31.2%(t=-5.391,P<0.001)和39.5%(t=-13.328,P<0.001)。流式细胞仪分析细胞周期提示EBV-miR-BART1过表达可以促进鼻咽癌细胞进入增殖期而提高细胞的体外增殖能力,裸鼠皮下成瘤实验提示是EBV-miR-BART1可以促进鼻咽癌细胞的增殖能力(P<0.05)。接着,我们采用慢病毒过表达miRNA和miRNA inhibitor沉默miRNAs策略,探讨更感兴趣的EBV-miR-BART1过表达对鼻咽癌细胞侵袭转移的影响作用。Transwell小室检测EBV-miR-BART1过表达对鼻咽癌细胞迁移能的影响,结果表明,EBV-miR-BART1过表达使CNE1细胞和5-8F细胞的迁移能力分别显著增强了 2.87 倍(t=-7.113,P<0.01)和 1.76 倍(t=-5.513,P<0.001)。Boyden侵袭小室实验同样显示,EBV-miR-BART1过表达使CNE1和5-8F细胞的侵袭能力分别显著增强了 1.85 倍(t=-6.226,P<0.001)和 1.69 倍(t=-7.003,P<0.001)。划痕实验的结果支持侵袭小室实验结果,即 EBV-miR-BART1的过表达同样增强鼻咽癌细胞的迁移运动能力。裸鼠肝包膜下种植鼻咽癌细胞也证实EBV-miR-BART1过表达能明显增强鼻咽癌细胞的淋巴结转移能力。当我们将特异性针对EBV-miR-BART1成熟体的miRNA inhibitors转染到稳定过表达EBV-miR-BART1的CNE1-BART1,5-8F-BART1细胞后,我们发现鼻咽癌细胞的侵袭和转移能力均显著下降(P<0.05),EBV-miR-BART1-5p和EBV-miR-BART1-3p的inhibitor表现出对鼻咽癌细胞侵袭转移能力不同程度的抑制,而且两者还有一定的协同作用(P<0.05)。以上的研究结果表明,EBV-miR-BART1参与了鼻咽癌的发生发展,一方面能促进鼻咽癌细胞的体外增殖与体内成瘤能力,更重要的是与鼻咽癌细胞的侵袭转移尤其是淋巴结转移密切相关。3.寻找EBV-miR-BART1的宿主靶基因应用RNA deep sequencing高通量测序技术,我们比较CNE1-BART1与CNE1-mock细胞之间的基因差异表达谱,共获得1550个差异表达大于等于2倍的可能与EBV-miR-BART1作用相关的基因,其中与EBV-miR-BART1作用正相关的基因555个,与EBV-miR-BART1作用负相关的基因995个。经GOfact和KEGG pathway分析,发现它们发挥的生物学功能主要包括Focal粘附、细胞周期、细胞粘附、p53信号通路、癌症通路(Pathway in Cancer)、MAPK、ECM受体相互作用、ErbB、Wnt及TGF-beta等信号通路的调控。由于这些生物学功能涉及到了肿瘤发生发展及侵袭转移的多个阶段,因而我们推测EBV-miR-BART1在鼻咽癌中高表达后,可通过直接或间接方式调控下游一系列基因的表达变化进而引起鼻咽癌细胞多方面生物学特性的改变,其中与转移侵袭相关的基因主要有PTEN、N-RAS、CHUK、SOS2、BAX、STAT1、PRKX1、PLA2G12A、PLA2G4A、TNFRSF10D、CDK1、CYCS和ROCK1等,与转移侵袭相关的主要信号通路有Pathway in cancer、P53信号通路、细胞粘附信号通路、Wnt信号通路以及VEGF信号通路等。通过文献调研和RNAhybrid生物信息学预测,我们发现EBV-miR-BART1有可能靶向调控肿瘤抑制基因PTEN(phosphatase and tensin homolog),且EBV-miR-BART1 的两个成熟体 EBV-miR-BART1-5p 和 EBV-miR-BART1-3p 种子序列均与PTEN的3’UTR有很好的互补结合区,提示PTEN是EBV-miR-BART1的候选靶基因。于是,我们构建了 pEZX-wtPTEN 3’UTR以及针对 EBV-miR-BART1 两个成熟体的 EBV-miR-BART1-5p 和EBV-miR-BART1-3p 的突变质粒(分别命名为 pEZX-mut1 PTEN 3’UTR、pEZX-mut2 PTEN 3’UTR),用于荧光素酶报告基因实验。将各重组质粒和EBV-miR-BART1s mimics、EBV-miR-BART1s inhibitors 分别共转染 293T 细胞,检测荧光素酶活性,结果发现,pEZX-wt PTEN 3’UTR分别与EBV-miR-BART1-5p mimics,EBV-miR-BART1-3p mimics 或 EBV-miR-BART1 俩成熟体的mimics共转染可显著降低荧光素酶的活性(F=233.209,P<0.001)。随后,我们又采用细胞免疫荧光化学的方法,检测PTEN在EBV-miR-BART1过表达细胞及其对照细胞中的表达情况,结果发现,相对于对照组细胞,PTEN在EBV-miR-BART1过表达细胞中的表达下调。此外,我们还检测了鼻咽癌组织及慢性鼻咽炎组织中PTEN的表达,结果显示,与慢性鼻咽炎组织相比,PTEN mRNA在鼻咽癌组织中表达下调7.09倍(t=4.750,P<0.001)。分析同一组鼻咽癌组织标本中PTEN mRNA表达与EBV-miR-BART1s的表达的关系,我们发现PTEN mRNA 的表达与 EBV-miR-BART1-5p 和 EBV-miR-BART1-3p 的水平均呈负相关(r=-0.493,P=0.009;r=-0.512,P=0.006)。以上结果证实,在鼻咽癌中PTEN是EBV-miR-BART1的靶基因。在此基础上,我们在EBV-miR-BART1过表达细胞中,回复PTEN的表达,观察PTEN表达改变是否能逆转EBV-miR-BART1过表达对鼻咽癌细胞侵袭转移能力的影响。Transwell小室与Boyden小室实验结果表明,回复PTEN的表达后,EBV-miR-BART1过表达细胞的迁移侵袭能力降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。这一结果与EBV-miR-BART1 inhibitors引起的抑制作用非常类似。充分结果表明,EBV-miR-BART1促进鼻咽癌细胞侵袭转移的生物学功能确实是通过调控PTEN的表达来实现的。4.EBV-miR-BART1参与鼻咽癌发生、转移分子机制的探讨PTEN(Phosphatase and tensin homolog)自 1997 年首次报道,是迄今发现的第一个具有双重特异磷酸酶活性的抑癌基因,是继p53后另一个较为广泛的与肿瘤发生发展密切相关的基因。PTEN蛋白在细胞生长、凋亡、粘附、迁移和浸润等方面具有重要作用;也是众多肿瘤预后的评价指标。为了探讨EBV-miR-BART1过表达下调PTEN在鼻咽癌发生发展中确切机制,我们采用western blot和免疫荧光技术鉴定相关信号通路分子表达水平的改变。Western blotting结果提示EBV-miR-BART1可以下调PTEN蛋白的表达,进而上调其下游信号通路中FAK、Shc、ERK、AKT等基因的磷酸化水平,从而导致细胞的活动能力增强,促进细胞的迁移运动能力。我们采用鬼笔环肽对EBV-miR-BART1过表达细胞及其对照细胞中的纤维状肌动蛋白(fibrosactin,F-actin)进行染色,并在荧光共聚焦显微镜下观察细胞内微丝的形态,结果显示,在EBV-miR-BART1过表达细胞中的微丝的结构密集,而对照组细胞中的细胞微丝等结构则稀少;western blotting检测EMT代表性指标(E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin)发现在EBV-miR-BART1过表达细胞中E-Cadherin表达下调,而N-Cadherin和Vimentin则表达上调。这些现象提示EBV-miR-BART1可能通过调控PTEN及其下游基因的表达,进而导致肌动蛋白等细胞骨架的重构以及鼻咽癌细胞EMT样改变进而促进细胞的运动潜能,从而导致肿瘤发生转移。_结论:1.应用miRNA表达谱芯片技术,筛选出在鼻咽癌组织和慢性鼻炎组织中显著差异表达的miRNAs,其中鼻咽癌中表达上调的miRNAs有24个,表达下调的miRNAs有46个;表达上调的miRNAs中EBV-miR-BARTs占62.5%(15/24),提示EBV-miR-BARTs的表达上调可能是鼻咽癌发生发展的比较重要标志物2.EBV-miR-BART1表达上调能促进鼻咽癌细胞的体外增殖和运动潜能以及增强鼻咽癌细胞的成瘤能力与淋巴结转移,EBV-miR-BART1过表达与鼻咽癌的淋巴结转移和临床分期密切相关;3.抑癌基因PTEN是本研究筛选获得的EBV-miR-BART1的宿主靶基因,PTEN低表达能促进鼻咽癌患者的淋巴结转移和临床进展,并与EBV-miR-BART1表达呈负相关性,PTEN基因过表达能抑制EBV-miR-BART1过表达鼻咽癌细胞的迁移运动能力;4.EBV-miR-BART1过表达可以下调抑癌基因PTEN的表达水平,进而上调PTEN下游FAK、Shc、ERK、AKT等基因的磷酸化水平,导致肌动蛋白等细胞骨架的重构和EMT样转化,从而促进鼻咽癌的转移。