槲皮素和芦丁在家蚕幼虫中对解毒酶的诱导模式

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黄酮类是广泛分布于植物体内且具有多种生物活性的次生代谢物,其对于动植物有多种重要作用。槲皮素和芦丁属于植物黄酮类物质,其分布较为广泛且是植物防御性的次生物质,对昆虫的发育和生长有一定的抑制作用。与植物防御策略相对应,昆虫也进化出多种适应机制,其体内存在大量的解毒酶系,如参与初级代谢的细胞色素P450单加氧酶(P450)和羧酸酯酶(COE),参加次级代谢的谷胱甘肽转移酶(GST)和葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)等,它们的大量表达可以解毒槲皮素和芦丁等次生物质。在昆虫中,槲皮素和芦丁对于解毒酶的诱导表达已有一定的研究,但相关研究主要集中于生理生化水平,而在分子水平仅鉴定了某一类解毒酶的诱导表达情况。作为鳞翅目昆虫的重要模式生物,家蚕(Bombyx mori)主要以桑叶为食,而桑叶中也存在含量较高的槲皮素、芦丁等次生物质,这暗示着在适应性进化过程中,家蚕可能已形成了一套对桑叶有毒次生物质解毒的作用机制。因此,本研究主要以家蚕作为模型来研究鳞翅目昆虫对槲皮素的解毒代谢作用机制。分别用添加不同浓度梯度槲皮素和芦丁的饲料喂食家蚕幼虫一定时间,研究槲皮素和芦丁对家蚕幼虫生长的影响情况和暴露后家蚕体内3种解毒酶P450、GST和COE的活性变化,针对酶活性被槲皮素诱导程度较高且较可能参与槲皮代谢的两种酶P450和GST,参考已有研究,分别选取8个CYP和7个GST基因作为候选基因,进行了半定量和定量PCR验证,鉴定可诱导的解毒酶基因。主要结果如下:1.生长数据表明家蚕暴露于0.5%槲皮素的体重增加量与对照相当,其他浓度处理组:0.1%,1%,3%均有明显的抑制家蚕幼虫生长现象,而芦丁抑制家蚕生长现象不明显。2.生化数据显示0.5%槲皮素和1%槲皮素是处理时解毒酶酶活诱导较大的两个浓度,在家蚕中肠中,三种解毒酶活性被槲皮素诱导的最大程度分别为:P450活性诱导程度最大组为1%槲皮素处理7天组,被诱导2.3倍;以枯烯过氧化氢和1-氯-2,4-二硝基苯为底物的GST活性诱导程度最大组均为1%槲皮素处理7天组,分别被诱导4.1倍和2.6倍;COE活性诱导程度最大组为0.5%槲皮素处理7天组,被诱导2.3倍。3.半定量PCR结果以及实时定量PCR结果都表明:CYP6AB5在0.5%槲皮素长期处理的中肠中被诱导程度最大,约为对照的10.9倍。CYP6B29在1%槲皮素长期处理的中肠中被诱导程度最大,达6.2倍。在1%槲皮素长期处理的中肠中GSTe8被诱导程度最大,达7.1倍。槲皮素对解毒酶活性的影响是通过多基因综合作用而达到的,这种影响随处理时间、槲皮素浓度及组织的变化而变化。4.系统进化分析表明家蚕的CYP6AB5序列和欧洲防风草结网毛虫同属CYP6AB亚家族的CYP6AB3同源关系相对较近,相似性为56%;家蚕CYP6B29序列与棉铃虫的CYP6B6及美洲棉铃虫的CYP6B27、CYP6B9、CYP6B8和CYP6B28相似性较近,相似度为58%-61%。5.基于本研究的实验结果和以前的研究基础推测了槲皮素在家蚕体内的代谢途径。本研究首次从分子水平上研究槲皮素和芦丁对家蚕中三种解毒酶的诱导模式,并初步探讨了家蚕体内槲皮素解毒代谢作用机制。该研究不仅有助于我们理解家蚕对桑树的适应性进化机制,而且也为后续的RNAi控制害虫研究打下基础。
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