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2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种全身性代谢性疾病,其临床特征主要包括两个方面:(1)高血糖;(2)高血糖引起的全身各组织器官损伤。研究表明,几乎所有T2DM患者体内都伴随着胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)—胰岛素敏感性/反应性下降,是胰岛素生理效应降低的一种临床表现,即胰岛素的靶细胞无法有效的利用胰岛素,从而导致在整个机体水平葡萄糖代谢紊乱,血糖升高。目前,对IR的研究主要集中在肝脏、脂肪等与物质代谢密切相关的组织中,其中肝脏作为体内最大的代谢器官,在血糖控制中发挥着关键的作用。到达肝脏的葡萄糖主要通过以下方式参与体内能量代谢:(1)分解供能;(2)转化为糖原储存;(3)转化为脂肪、蛋白质等非糖物质储存和利用。因此,肝细胞糖代谢紊乱在IR的发生和发展中发挥着重要的作用。目前,IR的发生机制尚不清楚,可能与胰岛素信号通路的转导异常有关。胰岛素信号通路的失衡主要和通路中一些关键蛋白的表达或活化(通常表现为磷酸化)有关,例如胰岛素受体(insulin receptor,InsR)、胰岛素受体底物(Insulin receptor substratel,IRSI)、磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、葡萄糖转运蛋白 4(glucose transporter 4,GLUT4)和糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)等,通过抑制葡萄糖摄取和糖原合成,导致葡萄糖利用率降低,血糖升高。G 蛋白偶联受体激酶 2(G protein coupled receptor kinase 2,GRK2)是一种丝/苏氨酸激酶。GRK2是信号网络的综合节点,它的作用主要有两方面:(1)介导G蛋白偶联受体的脱敏和复敏;(2)抑制或活化蛋白。文献报道,GRK2可以抑制InsR表达和IRS1酪氨酸磷酸化,同时损伤InsR/IRS1/PI3K胰岛素信号通路,导致胰岛素作用通路受损而引起IR。抑制GRK2可以显著增加FL83B小鼠肝上皮细胞糖原合成和改善db/db小鼠的糖脂代谢。因此,GRK2可能是药物调节IR的新靶点。芍药苷-6-氧-苯磺酸酯是课题组将芍药苷(paeoniflorin,Pae)与苯磺酰氯反应而生成的酯类化合物(代号CP-25)。研究表明,CP-25通过抑制GRK2调节炎性信号通路传导,抑制促炎因子的产生,发挥免疫调节作用,能够明显改善佐剂性关节炎和胶原诱导性关节炎动物模型的炎症。炎性反应在T2DM病程进展中发挥重要作用,体内的炎症可以广泛的破坏胰岛β细胞和胰岛素作用的各靶细胞的结构和功能,导致胰岛素分泌减少,胰岛素的生理效应降低,从而引起IR。但CP-25能否通过调节GRK2改善IR不清楚,因此,本研究旨在探讨CP-25对T2DM小鼠肝脏胰岛素抵抗的改善作用,以及CP-25通过调节GRK2对胰岛素信号通路的影响,为IR治疗提供新的策略。目的:明确CP-25对T2DM小鼠肝脏IR的改善作用,揭示CP-25通过GRK2对胰岛素信号通路的调节作用及其分子机制。方法:高脂联合链脲佐菌素腹腔注射C57BL/6小鼠构建T2DM动物模型,随机分为T2DM 组、CP-25 组(70mg/kg)、CP-25(70mg/kg)联合格列齐特(20mg/kg)组、格列齐特组(20mg/kg)、二甲双胍组(200mg/kg),每组12只;同时设立正常组,每组C57BL/6小鼠12只。造模成功后开始给药,给药五周,每天灌胃一次。每周称量各组小鼠体重。自给药开始,每周测量各组小鼠空腹血糖一次。给药5周后,检测各组小鼠葡萄糖耐量及血清胰岛素水平,计算并评估胰岛素抵抗指数。各组小鼠肝脏进行苏木精-伊红染色,观察CP-25对肝脏病理的影响。采用Western blot和免疫荧光检测肝组织GRK2、InsR、p-IRS/IRS、PI3K和p-GSK3β/GSK3β表达变化。高浓度胰岛素刺激HepG2建立细胞IR模型,观察CP-25对IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗、糖原含量和 GRK2 及 InsR、p-IRS/IRS、PI3K、p-GSK3β/GSK3β和GLUT4表达的影响。利用免疫共沉淀和激光共聚焦显微镜观察GRK2和InsR、GRK2和IRS之间的相互作用;GRK2 siRNA和GRK2抑制剂GSK180736A分别沉默GRK2基因表达和抑制GRK2活性来验证抑制GRK2在胰岛素信号通路调节中的作用。结果:1.CP-25对T2DM小鼠体重、糖耐量和胰岛素敏感性的影响CP-25对T2DM小鼠体重调节作用明显,与T2DM组相比,CP-25单药组和CP-25联合格列齐特组小鼠体重明显增加(P<0.05);CP-25联合格列齐特能够明显降低T2DM小鼠空腹血糖和血清胰岛素水平(P<0.01,P<0.01);CP-25和CP-25联合格列齐特均可使T2DM小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性增加(P<0.05,P<0.01)。其中,CP-25联合格列齐特组疗效最明显。2.CP-25对T2DM小鼠肝脏病理的影响苏木精-伊红染色显示CP-25和CP-25联合格列齐特组均能明显改善T2DM小鼠肝脏损伤,减少脂质空泡和不同程度肝细胞坏死,保持肝细胞结构完整性。3.CP-25对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗和糖原含量的影响1μM胰岛素刺激HepG2细胞48h,建立IR细胞模型。不同浓度CP-25(1μM、100nM、10nM和1nM)干预,IR-HepG2细胞葡萄糖消耗和糖原含量明显增加。4.CP-25对胰岛素信号通路的调节作用及其机制Western blot和免疫荧光检测结果显示,CP-25和CP-25联合格列齐特给药组可以明显增加肝组织InsR、p-IRS/IRS和PI3K表达,抑制GRK2表达和GSK3β磷酸化;不同浓度 CP-25(1μM、100nM、10nM 和 1nM)可以明显增加 InsR、p-IRS/IRS、PI3K和GLUT4表达,抑制GRK2表达和GSK3β磷酸化。免疫共沉淀和激光共聚焦共定位结果显示CP-25可以抑制GRK2和InsR、GRK2和IRS1之间的相互作用。5.GRK2表达和功能的下调对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗、糖原含量、胰岛素信号通路的影响GRK2 siRNA瞬时沉默GRK2基因表达和GRK2抑制剂GSK180736A抑制GRK2活性都可以增加IR-HepG2细胞葡萄糖消耗、糖原含量和胰岛素信号通路蛋白(InsR、p-IRS/IRS、PI3K、GLUT4)表达,抑制 GSK3β磷酸化。结论:1.CP-25改善T2DM小鼠糖代谢紊乱和IR,缓解肝脏损伤;增加IR-HepG2细胞葡萄糖消耗和糖原含量。2.GRK2和InsR、GRK2和IRS1之间的相互作用抑制InsR表达和IRS1酪氨酸磷酸化,共同阻碍InsR/IRS1/PI3K信号通路的传导而诱导IR。CP-25改善肝脏胰岛素抵抗的机制可能与CP-25抑制GRK2表达和活性而上调胰岛素信号通路有关。3.CP-25联合格列齐特不仅可以提高格列齐特的降血糖作用,还可以更好地保护T2DM小鼠肝脏损伤。因此,CP-25联合降血糖药物治疗T2DM肝脏IR可能具有重要的应用前景。