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琼胶寡糖作为一种新型的海洋功能性低聚糖,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、美白和保湿等生物活性,已成为国内外研究的热点。根据还原性末端的不同,琼胶寡糖可分为琼寡糖(AOs)和新琼寡糖(NAOs)。酶解法制备琼胶寡糖反应条件温和,能耗低,且酶催化具有高效性和专一性,能够选择性地切断糖苷键,因此,采用酶解法制备琼胶寡糖的报道较多。很多学者从海洋细菌中分离琼胶酶,然而迄今为止,实现规模化生产的只有从大西洋假单孢菌(Pseudoalteromonas)中分离的β-琼胶酶,但其价格昂贵,也仅限应用于科研工作,严重阻碍了琼胶寡糖的开发与应用,因此琼胶酶放大生产的研究对实现琼胶寡糖的广泛应用具有重要的意义。本文以本课题组筛选得到的一株分泌β-琼胶酶的需钠弧菌Vibrio natriegens HJPHYXJ-1为出发菌株,中试放大产琼胶酶,并探索实现琼胶酶循环利用的方法;分离纯化琼胶酶的酶解产物,得到纯度较高的新琼寡糖单体,进一步研究酶解产物的生物活性。主要研究结果如下:(1)琼胶酶的放大生产及循环利用:中试放大规模为5 L和75 L,实验结果表明500 mL摇瓶,5 L和75 L发酵罐所产琼胶酶的酶活分别为357.75 U/mg,376.7 U/mg和350.695 U/mg,说明5 L和75 L发酵罐中试放大效果良好。为减少新琼寡糖生产成本,采用超滤管回收酶解液中的琼胶酶,可实现琼胶酶循环利用。(2)新琼寡糖的分离纯化:琼胶酶与琼胶反应3 h后,得到聚合度为2~12的新琼寡糖,酶解产物经透析除盐、活性炭吸附除色素后,采用Sephadex LH-20层析柱分离,得到新琼寡糖单体,经高效液相色谱检测,新琼二糖纯度为85.51%,新琼四糖纯度为97.83%,新琼六糖纯度为90.03%,新琼八糖纯度为97.56%,新琼十糖纯度为85.4%,新琼十二糖纯度为91.89%。(3)新琼寡糖预防脂肪肝作用:在新琼寡糖浓度为500μg/mL时,油酸诱导的脂肪积累抑制率达58.2%,超氧化物歧化酶(SOD)活性提高70.2%,丙二醛(MDA)清除率达53.6%,说明新琼寡糖能有效抑制油酸环境脂肪的积累,增强细胞内超氧化物歧化酶的活性,有效抑制细胞脂质过氧化。(4)新琼寡糖降血脂作用:构建高脂和高胆固醇模型,实验结果表明新琼寡糖浓度为500μg/m L时,对高脂环境下HepG2细胞内甘油三酯(TG)抑制率达44.8%,超氧化物歧化酶活性提高86.2%,对丙二醛清除率为55%;在高胆固醇环境下,新琼寡糖浓度为500μg/mL时,总胆固醇(TC)的抑制率为48.3%,超氧化物歧化酶活性提高42.4%,丙二醛清除率达74%。说明新琼寡糖能有效抑制HepG2细胞脂质的积累,增强细胞抗氧化能力,有效清除丙二醛。综上,中试放大所产琼胶酶的酶活检测结果说明中试放大效果良好,实现琼胶酶的量化生产具有一定的可行性。采用超滤管回收酶解液中的琼胶酶,可实现琼胶酶的循环利用。将琼胶酶与琼胶反应3 h的产物经除盐、除色素后,采用Sephadex LH-20柱层析,得到纯度较高的新琼寡糖单体。体外细胞实验说明新琼寡糖具有预防脂肪肝和降血脂的作用。