目的TIPE2 (tumor necrosis factor-a induced protein 8 like 2)是2002年新发现的一个维持免疫系统自稳平衡必需的基因之一,属于TIPE家族成员之一,编码的蛋白中含有6个α螺旋和类似死亡效应结构域(death effect domain, DED)的结构域,。可以和如Caspase 8等含有DED结构域的蛋白结合,发挥抑制凋亡的作用。其高分辨率晶体结构显示该分子中间存在一个巨大的疏水性凹槽,猜测可能是与协同因子结合的部位。研究表明,将小鼠的TIPE2基因敲除后,小鼠表现为体重下降、脾肿大、多器官出现自发性炎症,且炎症反应加剧,细胞实验发现TIPE2抑制NF-kB信号通路的活化。初步研究证明它是一种新型的负性免疫调节蛋白在固有免疫反应和适应性免疫反应中均发挥负性调节作用。目前关于TIPE2的研究很少,并且主要来自小鼠,关于TIPE与人类疾病的关系研究也非常少。我们在前期研究中发现人类系统性红斑狼疮患者和乙型肝炎患者外周血单个核细胞中TIPE2 mRNA的表达显著降低,并且与疾病病情发展有关,而TIPE2与其他人类自身免疫性疾病的关系尚不清楚。类风湿性关节炎是以慢性对称性多关节炎为主要表现的一种全身性疾病。目前病因尚不明确,一般认为是感染后引起的自身免疫反应,招致以滑膜炎为基础的关节病变,免疫细胞参入了整个炎症过程。TIPE2作为一种新的免疫负调控分子是否参与了类风湿关节炎炎症反应过程?目前尚未见报道。为了研究TIPE2表达特点及其与类风湿关节炎的关系,本研究通过采集类风湿关节炎病人发作期时的外周血单个核细胞,采用实时荧光定量PCR的方法检测了TIPE2的表达水平,并分析了TIPE2表达与类风湿关节炎临床指标的关系,对揭示人TIPE2的功能以及在疾病中的作用提供了线索。材料与方法1类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞中TIPE2表达的检测1.1病例的选择与标本的收集：根据实验方案的要求,收集2010年3月到2010年9月类风湿关节炎发作期时的病例50例,全部符合1987年美国风湿病协会(ARA)修订的类风湿性关节炎的诊断标准。同时选取30例年龄与性别相匹配的非类风湿关节炎即正常健康人,为下一步实验作好物质基础。1.2外周血单个核细胞总RNA的抽提及cDNA的制备Trizol法抽提外周血单个核细胞总RNA,紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度,波长为260/280nm处的吸光度值为1.8-2.0时用于实验,统一定量为2gg,反转录酶进行反转录制备cDNA。1.3半定量RT-PCR及实时荧光定量RT-PCR法检测TIPE2基因的表达根据引物设计的原则,应用Premier Primer 5.0引物设计软件设计引物,为了避免基因组DNA受到污染,因此所设计引物均跨不同外显子。应用半定量RT-PCR及实时荧光定量RT-PCR法检测类风湿性关节炎患者和健康对照者新鲜分离的PBMCs中TIPE2基因的表达。2.类风湿性关节炎有关指标的检测利用RA病人外周血,根据临床常规方法,检查类风湿性关节炎相关指标：如血沉,抗链“0”,类风湿因子,C反应蛋白等指标。2、统计学处理利用Prism GraphPad软件对类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞TIPE2的表达与健康对照人群TIPE2的mRNA的表达的相关性分析,以及与类风湿性关节炎临床参数等进行相关性分析,所有计量资料以均数士标准差(X士S)表示,以a=0.05作为检验水准。绘制散点图后对TIPE2进行直线相关分析,以P=0.05作为相关系数的检验水准。两组间比较采用t检验。结果1 TIPE2 mRNA在类风湿性关节炎患者PBMCs中的表达明显高于健康对照组采用RT-PCR法即实时荧光定量方法检测RA患者和健康对照人群TIPE2 mRNA的表达。根据MJ-Research实时荧光定量扩增仪的性能和扩增产物的特性,用2-ΔΔCT来表达所表达基因的表达水平。依据MJ-Research实时荧光定量扩增仪扩增产品专业分析软件,可以得到所检验的RA患者和正常对照人的TIPE2表达水平。结果显示RA患者外周血单个核细胞中的TIPE2表达水平为0.0129±0.0122,正常健康对照人的TIPE2表达水平为0.0056±0.0046,经t检验得P值为0.0089,可以得到TIPE2表达水平在所检验的RA患者和正常对照者中有显著的差异,其表达在RA患者中比正常对照者中的表达明显增高。2高表达TIPE2的类风湿性关节炎患者血沉明显高于低表达TIPE2的患者为了分析TIPE2表达与类风湿性关节炎患者临床指标的关系,我们以TIPE2表达的平均值为线,平均值以上为高表达组,平均值一下为低表达组,比较TIPE2高表达组和低表达组患者血沉(ESR)的水平的差异,发现TIPE2高表达组RA患者外周血ESR的水平明显高于TIPE2低表达组病人(p=0.0428),血沉是RA病情的重要指标,提示TIPE2的水平与RA的严重程度有关。3高表达TIPE2的类风湿性关节炎患者类风湿因子的水平明显高于低表达TIPE2的患者水平为了进一步确定TIPE2的水平与RA的严重程度的关系,我们进一步分析了TIPE2表达与RA患者类风湿因子的关系,发现高表达TIPE2的RA患者类风湿因子明显高于低表达TIPE2的患者(p=0.0272)4. TIPE2表达的高低对风湿性关节炎患者血清C反应蛋白(CRP)及抗链球菌“O”(ASO)无明显影响C反应蛋白(CRP)及抗链球菌“O”(ASO)也是RA常规的临床检测指标表达TIPE2的RA患者与低表达TIPE2RA患者间C反应蛋白及ASO水平无显著性差异(CRP:p=0.3333, ASO:p=0.8979),表明TIPE2表达的高低对风湿性关节炎患者血清C反应蛋白(CRP)及抗链球菌“O”(ASO)无明显影响。结论1. TIPE2-mRNA在类风湿性关节炎患者PBMCs中的表达明显高于健康对照组。2.高表达TIPE2的类风湿性关节炎患者血沉和类风湿因子的水明显高于低表达TIPE2的患者。3. TIPE2表达的高低对风湿性关节炎患者血清C反应蛋白(CRP)及抗链球菌“O”(ASO)无明显影响创新性和意义TIPE2是新发现的基因,与疾病的关系尚不清楚。目前关于TIPE2功能及特性的研究多来自小鼠,TIPE2在人类各种自身免疫性疾病中的特性尚不清楚。本研究首次发现人TIPE2在类风湿关节炎发作期高表达于单个核细胞,且高表达TIPE2的类风湿性关节炎患者血沉和类风湿因子明显高于低表达TIPE2的患者,提示TIPE2的水平与RA的严重程度有关局限性：TIPE2是新发现的基因,由于对其很多特性不太明确,初期的研究处于摸索阶段,使研究进展受到很大的限制。