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研究背景与目的:丙型肝炎（简称丙肝）是一种全球常见的感染性疾病,它严重威胁着人类的健康安全。丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）属于单股正链RNA病毒,主要通过血液传播。临床上治疗丙肝,除经典的利巴韦林合并干扰素疗法外,主要是使用一般抗病毒药物进行治疗。虽然国内外已经陆续开展了针对HCV保守蛋白和关键因子的单克隆抗体药物研究,但是目前市场尚未有治疗丙肝的单克隆抗体药物问世。本课题中,我们利用已建立的“人记忆性B细胞体外活化特异筛选法”平台快速研发全人源特异性针对HCV的单克隆抗体药物,以期为临床上治疗丙肝提供有效的药物。实验方法与结果:1.HCV抗原蛋白的制备:选取HCV表面E2糖蛋白作为抗原蛋白,合成原核表达质粒p GEX-HCV-E2,并利用原核细胞系统进行抗原蛋白的表达及纯化。通过摸索抗原蛋白（HCV-E2）的最佳表达及纯化条件,成功纯化出可用于后续抗体筛选的抗原蛋白。2.HCV特异性记忆B细胞的分离与活化:收集丙肝康复志愿者全血50ml进行单核细胞分离,通过细胞表面特异性标志物筛选记忆B细胞,体外诱导记忆性B细胞活化成浆细胞并分泌抗体,最后利用HCV特异性抗原E2通过酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA）方法鉴定分泌特异性抗体的阳性浆细胞。结果显示,我们在体外成功活化促使浆细胞分泌抗体,通过检测培养基上清中的抗体筛选到阳性细胞孔。3.抗体基因文库的构建:首先提取活化后阳性孔的浆细胞RNA并反转录为c DNA,通过巢式PCR两轮扩增、胶回收和酶切酶连等步骤将抗体重链和轻链基因分别克隆到真核细胞表达载体中,完成抗体重轻链可变区基因文库的构建。通过各个关键步骤验证确认,我们成功构建了抗体重轻链基因文库。4.特异性单克隆抗体的筛选:首先将重轻链质粒共转染HEK 293T细胞,然后对分泌到培养基中的抗体利用E2抗原进行ELISA逐级筛选,最终筛选出HCV特异性全人源单克隆抗体。通过逐级筛选验证的方法,成功从多种重轻链组合序列中筛选得到5株针对HCV表面E2蛋白的特异性全人源单克隆抗体。结论:1.我们在原核系统（大肠杆菌）中成功地表达出目的抗原蛋白（HCV-E2蛋白）并纯化,并通过验证表明其可用于HCV特异性抗体的筛选。2.通过特有筛选组合模式,我们成功筛选出5株针对HCV表面E2糖蛋白的特异性单克隆抗体,为开发治疗丙肝的单抗药物提供了前期基础。