研究背景鼻咽癌是一种发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤,多见于我国南方的广东、广西、湖南、福建、江西等华南地区,特别是广东省是全世界最高发的地区,故鼻咽癌又称“广东癌”。其起病隐匿,恶性程度较高,且具有极强的转移能力。尽管随着分子生物学技术和临床治疗水平的快速发展,鼻咽癌的临床治疗手段尤其是分子靶向治疗有了一些进步,而鼻咽癌的肿瘤形成涉及多个基因和信号通路相互作用,以及癌基因的激活和抑癌基因的失活,它们之间平衡的破坏是鼻咽癌发生、发展的分子机制。因此探索鼻咽癌发生、发展的相关基因及分子信号通路可以有助于揭示鼻咽癌的发病机制。ENKUR(又名Enkurin)相对分子量为29kDa,由10p12.]染色体上的ENKUR基因编码生成,由8个外显子组成,长3378bp,位于反义链上。2004年研究精子中TRPC(瞬时型感受器电位)通道活性和Ca2+偶联的机制时,通过酵母双杂交筛选发现了ENKUR,其高水平表达于睾丸和犁鼻器,并在其它组织中较低水平。ENKUR具有明显的模块化结构,其有三个结构域:C末端区与TRP通路相互作用;与IQ模体结合的Ca+2感受器;富含脯氨酸的N末端链接SH3域蛋白[1]。1、ENKUR蛋白的C端相关联的TRP通路主要有TRPC1、TRPC2、TRPC5,不包含TRPC3。TRPC是TRP超家族中的一员,其在体内,尤其在神经系统广泛表达,是一类对Ca2+通透的非选择性阳离子通道蛋白,可以调节细胞内钙离子稳态重要的离子通道。TRPC通道可被各种化学性和物理性刺激(如神经递质、激素、温度和机械刺激等)所激活,其激活机制相当复杂[2]。2、IQ模体通常是通过与GAP2、Ras GRF1和Myr4myosin结合成复合体连接钙调蛋白。ENKUR蛋白中的IQ模体结合的钙调蛋白是Ca2+的传导通路,它可以通过Ca2+的收集和释放来调控TRPC的开放或者关闭[1]。3、ENKUR的N端包括富含脯氨酸的大约100个残域。体外研究表明,此端有链接紧密的p85 PI3激酶的调节亚基和链接较弱的SH3结构域[3]。p85调节亚基包括p85 α、p85 β、p85γ三种,其中p85α是表达最多的调节亚基,p85调节亚基和p110催化亚基结合形成的异二聚体可以构成IA型PI3K[4]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是一类特异的催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶。在一般情况下,由其活化产物为3,4一二磷酸磷脂酞肌醇[pI(3,4)P2]和3,4,5一三磷酸磷脂酞肌醇[pI(3,4,5)P3],其作为第二信使与多种细胞内的靶蛋白结合并且激活,形成一个信号级联复合物,可以调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等。SH3结构域是真核生物蛋白结构域,能够与受体酪氨酸激酶磷酸化残基紧密结合,从而形成蛋白的复合物来进行信号转导,SH3结构域是最开始是鉴定研究癌基因Src时发现的蛋白组件,它可以识别富含脯氨酸和疏水残基的蛋白质,并与其结合,从而介导两种蛋白的相互作用。SH3结构域参与了多种细胞内的生化反应过程,包括细胞运动、信号转导及细胞增殖。哺乳动物的PI3K家族主要有三种类型,其中IA型PI3K和其下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT(或PKB)所组成的信号通路因为与肿瘤发生、进展具有相关性,近几年来备受大家瞩目。PI3K-AKT信号通路活性异常导致细胞恶性转化,并且此信号通路不仅可调节肿瘤细胞的增殖和存活而且与肿瘤细胞的迁移、粘附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关连[5]。AKT通过间接作用于细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂来影响细胞存活和凋亡[6,7]。当P15、P16、P21升高时,可以明显抑制细胞周期的进程;肿瘤血管形成是肿瘤发生转移的重要条件,P13K通过对β-Catenin通路的影响,参与血管内皮生长因子介导的内皮信号传递[8]。PI3K/AKT的激活是EMT在肿瘤发展中的一个重要特征,能抑制E-Cadherin的表达从而促进肿瘤转移[9]。总之,PI3K/AKT通路可促进细胞生存并维持细胞正常功能,且在肿瘤细胞恶性增殖、血管生成和转移等多方面起着重要作用。细胞周期包括细胞间期与分裂期两个阶段。细胞间期可分为三部分,包括DNA合成前期(G1期),DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)[10]。GO期为细胞是暂时脱离细胞周期的阶段,处于静止状态,目前认为肝细胞、甲状腺滤泡上皮细胞、心肌细胞为GO期细胞,在机体需要时可以重新进入细胞周期,也有人认为肿瘤干细胞多处于GO期,并且细菌的耐药性也多由于细胞处于GO期引起;G1期为DNA合成前期,主要是为S期中DNA的复制做准备工作;S期是细胞核内DNA复制期,为最关键的时期;G2期为DNA复制后有丝分裂前期,加工制造蛋白质阶段;M期是细胞进行有丝分裂的时期。所以细胞生长、有丝分裂时,需要逐次经过G1、S、G2、M期四个分期,周而复始的过程,进行机体的生长发育[1]。细胞周期调控机制的关键蛋白是CDKs(细胞周期依赖性蛋白激酶),是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。CDKs通过对相应底物的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化,驱动细胞周期向下一步进行,它们各自在特定时期内激活发挥作用,具有严格的时相性[12];CDKs目前已知知晓有10种蛋白,重要的有CDK1(cdc2)、CDK2、CDK4和CDK6。其根据细胞周期素调控的不同周期发展阶段可分为:作用于G1期细胞周期蛋白(cyclinC、D、E),作用于G2期细胞周期蛋白(cyclin A)和作用于M期细胞周期蛋白(cyclin B)[14]。其中作用于G1期细胞周期蛋白CyclinD1可与CDK4和CDK6绑定结合,促进细胞从G1期进入S期。现阶段Trents等人研究发现,由于CyclinD1作用位点位于细胞周期,所以有CyclinD1过表达的肿瘤组织对放射治疗比较敏感[15]。现阶段研究的与周期相关的蛋白还有细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂,其主要成员有:P15、P16、P21等。它不仅于肿瘤抑制作用密切相关,又可以通过抑制CDKs复合活性,协调细胞周期,从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制密切结合。其中P21可以抑制多种CDKs的作用,参与细胞的增殖、衰老的调节;而P15、P16主要抑制CDK4和CDK6,使细胞阻滞在G1期[16]。上皮细胞-间充质转化(Epithelial Mesenchymal Transitions,EMT),是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在正常的生理过程如:胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病,发挥了重要作用。其主要的特征有细胞黏附分子(如E-Ca)表达量的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白(Vimentin)为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等[17-15]。通过EMT,正常的上皮细胞失去细胞极性,失去与基底膜的连接的上皮表型,获得了间质表型,如迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等。EMT是也上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。肿瘤细胞发生EMT后,可以形成新的有利于侵袭的细胞外基质(ECM)并且分泌与原来不同的细胞因子,并且在新的微环境定植后还可以再次横向分化,通过间质-上皮样表型转化(MET),形成与原发灶形态结构相似的转移灶[16-23]。而大部分鼻咽癌病人诊断时已出现转移,5年生存率很低,所以阐明调控鼻咽癌细胞发生EMT过程的分子机制,明确其在鼻咽癌的发生、发展、转移中的意义,并探索基于EMT的诊断方法及靶向治疗手段,有助于鼻咽癌治疗的攻克。ENKUR是本实验组在研究鼻咽癌NESG1基因时,通过酵母双杂交实验筛选出来的有相关作用的一个基因。研究发现,NESG1可能是一个抑制肿瘤发生、发展的相关基因,并且已经被证实在鼻咽癌中具有降低体外迁移侵袭能力、抑制细胞生长,阻滞细胞周期G1期向S期发展的作用[]24。但是在后续的研究发现NESG1与ENKUR无相互作用关系。通过文献的查找,发现现阶段对于ENKUR基因研究为空白,尤其在对肿瘤的作用的方面。其在鼻咽癌中的表达量、是否对鼻咽癌的发生发展、侵袭性转移性有作用都不可知,有待本实验室进行实验研究。由于ENKUR的N端链接紧密的p85、PI3激酶的调节亚基,所以本实验组提出假设ENKUR可能是一个与肿瘤发生、发展相关的基因,但是其是促进作用还是抑制作用尚且未知。然而在有关在细胞内ENKUR蛋白在哪些细胞器中发挥作用,以及在不同的细胞中对于相同的细胞器是否有不同的作用都未明确。本课题从表浅的方面着手,由于细胞增殖和游走侵袭是癌细胞维持生存的重要方面,所以本课题组主要研究了在过表达ENKUR后鼻咽癌细胞在细胞增殖和细胞游走侵袭这两方面的变化,借此为破口以便进行更深入的研究。研究目的1、研究ENKUR在鼻咽癌的表达特性2、建立稳定过表达ENKUR的鼻咽癌细胞系3、研究ENKUR对鼻咽癌细胞增殖的影响4、研究ENKUR对鼻咽癌细胞游走和侵袭的影响研究内容和方法1、研究ENKUR在鼻咽癌细胞株的表达特性利用RT-PCR分别检测ENKUR在23例鼻咽癌cDNA和25例正常鼻咽组织cDNA的表达情况;以及鼻咽癌细胞株SUNE-1、5-8F、CNE-1、CNE-2、HONE-1、HNE-1、6-10B、C666-1和非鼻咽癌细胞株NP-69中mRNA水平。2、建立ENKUR在稳定表达的鼻咽癌细胞系利用公司包装的慢病毒感染鼻咽癌细胞株HONE-1和SUNE-1,建立稳定过表达ENKUR的细胞株;采用Western blot进行过表达效率的鉴定,筛选出稳定过表达ENKUR基因的鼻咽癌细胞,建立稳定表达株。3、ENKUR对于鼻咽癌细胞增殖的影响①鼻咽癌细胞稳定过表达ENKUR后,MTT体外增殖实验分别检测对照组和处理组中细胞增殖的变化情况;②鼻咽癌细胞稳定过表达ENKUR后,使用EDU细胞增殖实验检测对照组和处理组中细胞增殖的变化情况;③鼻咽癌细胞稳定过表达ENKUR后,流式细胞仪检测细胞周期,对比对照组和处理组中处于S期细胞比例的变化情况;④鼻咽癌细胞稳定过表达ENKURB后,进行裸鼠皮下成瘤实验,检测细胞体外成瘤能力的改变,并取出肿瘤,记录肿瘤重量,比较空白对照组和处理组中肿瘤重量的变化情况;⑤鼻咽癌细胞稳定过表达ENKUR后,使用Western Blot实验方法检测细胞周期相关蛋白的变化,寻找与ENKUR有关的相关信号通路;⑥鼻咽癌细胞稳定过表达ENKUR后,瞬时干扰ENKUR的表达,进行增殖相关功能实验,确认变化是由过表达ENKUR后引起。Western blot检测干扰ENKUR后,与细胞周期相关的基因表达的变化。4、鼻咽癌细胞株稳定过表达ENKUR后对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制①鼻咽癌细胞稳定过表达ENKUR后,Transwell和Boyden细胞体外迁移侵袭实验检测处理组和对照组细胞迁移和侵袭能力的变化。②鼻咽癌细胞稳定过表达ENKUR后,用划痕实验检测处理组和对照组细胞迁移和侵袭能力的变化。③鼻咽癌细胞稳定过表达ENKUR后,Wester Blot实验检测细胞EMT相关蛋白的变化,寻找ENKUR调控细胞迁移和侵袭的相关信号通路。统计学分析:采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料结果用x±s表示。荧光定量PCR各细胞样本的2-ΔΔCt值的比较采用单因素方差分析(One-way AVOVA);对照组和处理组间比值、穿膜细胞数目、细胞间距等的比较采用两独立样本T检验;以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1、通过RT-PCR的方法检测25例鼻咽癌cDNA和23例正常鼻咽组织cDNA,8株鼻咽癌细胞以及鼻咽永久化上皮细胞NP69中ENKUR mRNA的表达情况,单因素方差分析(One-way AVOVA)的结果表明:ENKUR在正常鼻咽组织表达量高于鼻咽组织,并有统计学差异;8株鼻咽癌细胞和永久化鼻咽癌上皮细胞NP69中ENKUR的表达有差异,并有统计学差异。2、慢病毒感染HONE-1和SUNE-1细胞后,建立了稳定过表达ENKUR细胞株,通过Western blot实验证明成功的实现了ENKUR蛋白上调的过表达,有利于下一步实验的进行。3、ENKUR在鼻咽癌中抑制癌细胞的增殖及其分子机制①稳定过表达ENKUR的两株鼻咽癌细胞,MTT分别检测两株细胞的目的处理组和空白对照组中细胞增殖的变化,结果表明过表达ENKUR后的两株鼻咽癌细胞,通过细胞内一系列的活动可以抑制鼻咽癌细胞的增殖;②EDU、细胞周期实验检测显示,稳定过表达ENKUR的两株鼻咽癌细胞,处于G1期的细胞比例上升,S期的比例下降,鼻咽癌细胞被阻滞在分裂间期,导致其增殖能力减弱;③裸鼠体内成瘤实验结果表明,过表达ENKUR后鼻咽癌细胞在裸鼠皮下成瘤的重量与空白对照组相比减小,在统计学上两组实验结果有差异(P<0.05)具有统计学意义,基本证实了过表达ENKUR蛋白有抑制鼻咽癌细胞体内成瘤能力的作用;④Western blot检测稳定过表达ENKUR后,细胞增殖方面相关基因下调了,这证明了 ENKUR可能通过调节某种信号通路来调节鼻咽癌细胞的细胞增殖能力。4、ENKUR在鼻咽癌中促进癌细胞迁移和侵袭及其分子机制①Transwell和Boyden检测稳定过表达ENKUR的HONE-1和SUNE-1鼻咽癌细胞,可以发现ENKUR抑制了细胞迁移和侵袭能力,表明ENKUR可以抑制细胞迁移和侵袭;②划痕检测稳定过表达ENKUR的HONE-1和SUNE-1鼻咽癌细胞,可以发现ENKUR抑制了细胞迁移和侵袭能力,表明ENKUR 可以抑制细胞迁移和侵袭;③提取两株稳定过表达ENKUR的鼻咽癌和空白对照的鼻咽癌细胞后,Western blot实验显示上调了 EMT相关基因,提示ENKUR可能会影响鼻咽癌EMT进程。结论通过一系列的体外功能实验和小鼠体内成瘤实验,表明鼻咽癌细胞株稳定过表达ENKUR后,细胞增殖的能力减弱;通过Western blot检测ENKUR过表达后与增殖相关基因的改变,结果表明ENKUR对鼻咽癌细胞增殖的调控通过PI3K/AKT通路或者直接控制AKT调控;ENKUR还可以抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭,其调控可能是通过PIK/AKT或者wnt/β-catenin信号通路实现;以上结果提示,ENKUR可以通过加强或减弱细胞信号通路的途径,在某种程度上起到了抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭的作用,可能与鼻咽癌的发展,转移和预后相关。