维生素A通过其代谢产物视黄酸(retinoic acid, RA)在精子发生过程中发挥重要的作用。Stra8 (stimulated by retinoic acid gene)是一种能够被RA特异性诱导活化的基因,其表达具有发育阶段性,且在生殖腺中特异表达。Stra8基因敲除雄性小鼠不育,但其在精子发生中的作用机制尚未阐明。本课题从Stra8多克隆抗体的制备、Stra8过表达细胞株的构建及Stra8在不同模型小鼠睾丸组织中的表达三个方面初步探索了Stra8在精子发生中的表达情况,为深入研究Stra8在精子发生中的作用机制奠定了基础。第一,进行了Stra8原核蛋白的表达,应用纯化的Stra8蛋白免疫小鼠,获得了特异性Stra8多克隆抗体。首先通过PCR扩增,获得Stra8开放阅读框全长基因片段,应用分子克隆的方法插入到原核蛋白表达载体pET28a+中,构建了Stra8原核表达载体pET28a-Stra8。将其转化到大肠杆菌BL21 (DE3) plus后,用IPTG诱导Stra8原核蛋白表达,His-Tag柱亲和层析纯化蛋白,透析复性,用复性后的Stra8蛋白为抗原,腹腔注射免疫BalB/C小鼠,获得了小鼠Stra8多克隆抗体,并分别用ELISA、Western blot及免疫荧光检测法证实所得到的多克隆抗体能够特异性识别Stra8。第二,应用慢病毒表达系统,构建了稳定过表达Stra8的小鼠精原细胞株。将Stra8开放阅读框全长基因片段插入慢病毒载体GV341中,构建了慢病毒重组表达载体GV341-Stra8。然后将GV341-Stra8及两种辅助包装质粒共转染至293T细胞中,收集含慢病毒颗粒的上清,用浓缩后的慢病毒上清感染小鼠精原细胞系细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得了稳定过表达Stra8的小鼠精原细胞株。应用Western blot及免疫荧光检测法对细胞进行Stra8过表达的鉴定,结果发现,构建的细胞株能表达大量的Stra8蛋白,且Stra8蛋白同时表达于细胞质和细胞核中,以细胞质中表达居多。第三,成功制备了维生素A缺乏(vitamin A deficient, VAD)雄性小鼠及VAD恢复雄性小鼠模型,应用免疫荧光技术分析了Stra8在不同模型小鼠睾丸组织中的表达情况。用VAD饲料喂养雌雄性小鼠两周后合笼,新生雄性小鼠VAD饲料喂养13-14周后获得VAD小鼠。取100天左右VAD小鼠,给予维生素A正常的饮食,维持35天以上即可获得VAD恢复模型小鼠。应用HE染色法对睾丸组织进行形态学分析。在此基础上选取模型小鼠不同时期睾丸组织,通过Western blot、免疫荧光化学等方法研究Stra8的表达情况。结果发现,VAD小鼠从VAD饮食第81天起部分生精小管即开始出现生精紊乱,到100天时,生精小管中仅有支持细胞和少量精原细胞。VAD小鼠恢复正常饮食后第9天起,生精小管中初级精母细胞即开始出现,并逐渐增多,25天时基本可见到各种阶段的生精细胞,至35天时所有生精小管均完全恢复了正常。对Stra8蛋白的表达分析发现,在VAD小鼠的不同阶段,Stra8在睾丸组织中的表达具有逐渐减少的趋势,而VAD恢复组小鼠睾丸组织中的不同阶段,Stra8蛋白的表达水平随着精子发生的改善而呈现逐渐增高的趋势。通过上述研究,我们获得了特异性的Stra8多克隆抗体,构建了稳定过表达Stra8小鼠精原细胞株,同时,构建了VAD及VAD恢复小鼠模型,并分析了Stra8蛋白在模型小鼠不同阶段的表达情况。这些研究为将来进一步研究Stra8在精子发生中的作用机制奠定了基础。