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口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)是引起猪、牛、羊等偶蹄动物口蹄疫的重要病原,有七个血清型。全球范围内FMDV O型的流行状况最为复杂,我国近年来就先后有3个拓扑型中的4个谱系的病毒株传入并造成流行,是目前防控难度最大的病毒血清型。FMDV O型不同谱系病毒的抗原结构存在明显差异,表现为抗原匹配性与交叉免疫保护效果的不同;抗原结构变异分析是口蹄疫防控产品研制需要重点关注的问题。单个B细胞抗体技术是目前筛选识别不同位点中和抗体的最新方法,为研究抗原结构变异提供了丰富的抗体工具。本研究首先用FMDV O型3个谱系的毒株免疫牛,然后采集抗凝血分离牛外周血单个核细胞(PBMCs)。利用生物素标记的FMDV O型146S颗粒作为诱饵抗原,通过流式细胞术从免疫牛PBMCs中分选抗原特异性单个B细胞;通过单细胞PCR技术从单个B细胞中扩增牛IgG抗体重链与轻链可变区(VH与VL)基因序列,将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整IgG抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。通过酶联免疫吸附试验(ELISA),病毒中和试验(VNT),间接免疫荧光实验(IFA),Western-blot(WB)验证抗体的生物学活性。本研究共筛选表达了69株IgG亚型的全牛源单克隆抗体(mAbs),经ELISA、IFA、VNT验证,确定55株mAbs为FMDV O型特异性抗体。55株mAbs中,28株具有中和活性,其中13株为型内广谱中和抗体(broadly neutralizing antibody,bnAbs),可以中和FMDV O型3个拓扑型中的4个不同谱系毒株。采用多抗血清阻断ELISA发现13株型内bnAbs识别的抗原表位均表现出一定的免疫优势性。WB结果显示55株mAbs中有4株mAbs(E32、E53、F104、B66)结合线性表位,其中3株非中和mAbs(E32、E53、F104)结合衣壳蛋白VP2,另一株中和性mAb(B66)结合衣壳蛋白VP1的C末端。通过搜索IMGT数据库对55株mAbs的IGHV(D)J胚系基因定位分析,发现含有超长HCDR3的全部VH序列均使用牛胚系IGHV 1-7*02基因片段,而且中和抗体较非中和抗体偏爱使用牛胚系IGHV(D)J基因片段中的4个IGHV(1-7*02;1-10*01/2;1-2*01;1-21*01/1-33*01),3个IGHD(6-2*01;7-3*01;5-2*01)和一个单独的IGHJ(2-4*01)基因片段。综上所述,本研究首次建立了快速筛选制备FMDV O型全牛源广谱中和抗体的技术平台,获得了28株FMDV O型特异性中和抗体,为解析FMDV O型抗原结构变异奠定了基础。