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[目的]霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s Disease，HD）是起源于淋巴结和淋巴组织的恶性肿瘤，其发生大多与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化产生的某种细胞恶变有关。它以在反应性细胞包括淋巴细胞、浆细胞、组织细胞和纤维细胞的背景下，出现单核的霍奇金细胞（H）和多核的Reed-Sternberg细胞（RS）为特征。临床上以无痛性淋巴结肿大为主要表现，随病变进展向邻近淋巴结区蔓延，还可出现局部及全身皮肤瘙痒。尽管部分霍奇金淋巴瘤被认为是可以治愈的，但是还存在一些复发患者以及难治性患者，需要考虑使用新药来治疗这些患者。雷公藤内酯醇（triptolide，TPL）是从传统中药卫矛科雷公藤属雷公藤中提取的活性成份，临床已经广泛用于自身免疫性疾病，如类风湿关节炎，肾炎，红斑狼疮等的治疗。近年来的研究发现TPL还具有显著的抗肿瘤作用，我们前期的实验研究表明其对骨髓瘤细胞株亦有较好疗效，但TPL对霍奇金淋巴瘤细胞株的作用目前尚未见有报道。蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib，PS-341，VELCADE）近年来在多发性骨髓瘤的治疗中取得较好的疗效，也用于非霍奇金淋巴瘤的治疗，其机制主要通过下调核因子κB（NFκB）或者调控细胞周期蛋白和细胞凋亡通路而具有抗肿瘤作用，但是是否可用于霍奇金淋巴瘤的治疗尚无报道以及相关的临床资料。本实验旨在进一步研究TPL单独以及联合PS-341对霍奇金淋巴瘤细胞株的作用并初步探讨可能的作用机制，结合前人研究完善TPL对血液系统B细胞等恶性肿瘤的作用研究，为临床应用提供理论依据。[方法]1．采用MTT比色法检测TPL单独以及联合PS-341对霍奇金淋巴瘤细胞株L428体外生长的抑制作用。2．瑞氏—姬姆萨（Wright-Giemsa）染色，油镜下观察细胞形态。3．应用流式细胞仪，Annexin V和PI双染色，周期分析检测细胞凋亡。4．western-blot法检测TPL单独以及联合PS-341对L428细胞caspase3、9，PARP，Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax表达水平的影响。[结果]1．TPL、PS-341单独以及联合对L428细胞的生长的影响：MTT比色法检测结果显示，5—500ng／ml TPL处理L428细胞24h、48h、72h，细胞增殖明显受抑制，各组间差异显著（P值均小于0.001）。且生长抑制率与药物作用浓度呈正相关（P＜0.001）。TPL处理细胞24h、48h、72h后，L428的IC50分别各为901.31 ng／ml；12.13ng／ml；8.686ng／ml。当采用5—500ng／ml的TPL联合80ng／mlPS-341作用于L428细胞24小时，L428细胞生长明显受抑制，IC50降为7.246ng／ml，比TPL单药作用增强124.56倍，其抑制效果明显优于单药处理，细胞抑制率与药物浓度呈正相关。2．TPL单独与联合PS-341对L428细胞凋亡的影响：采用瑞氏—姬姆萨染色，油镜下观察TPL作用前后L428细胞形态学变化，结果显示，5—200ng／ml的TPL处理48小时后，L428细胞出现典型的凋亡形态学特征：细胞体积缩小，胞浆空泡化，细胞核染色质凝聚、边缘化，形成新月型核或环形核，细胞核碎裂，凋亡小体形成等。以流式细胞分析技术研究了细胞DNA含量、亚二倍体及磷脂酰丝氨酸（PS）转位。L428细胞用0-200ng／ml TPL处理48小时，PI的DNA染色结果显示亚二倍体凋亡细胞百分数（重复三次，以X±SD表示）分别为：0.05％±0.04，3.40％±1.18，4.69％±0.89，13.98％±0.69，15.68％±1.28。L428细胞分别用5ng／ml TPL、80ng／mlPS-341处理24h，5ng／ml TPL联合80ng／mlPS-341处理细胞24h，亚二倍体凋亡细胞百分数（重复三次，以X±SD表示）分别为0.02％±0，0.91％±1.14，4.89％±0.15，18.41％±3.84。细胞凋亡率与药物作用浓度正相关：r=0.782，P值小于0.01。L428细胞用5—500ng／ml TPL处理细胞48h，AnnexinV-PI双标记法结果显示早期凋亡细胞百分数（重复三次，以X±SD表示）分别为：4.86％±0.32，9.65％±0.40，11.19％±2.41，15.3％±1.18，23.24％±3.56（空白对照组为0.64％±0.21），细胞凋亡率与药物作用浓度呈正相关（r=0.784，P＜0.01）；L428细胞用5ng／ml TPL、80ng／mlPS-341以及用5ng／ml TPL联合80ng／mlPS-341处理24h，早期凋亡细胞百分数（重复三次，以X±SD表示）分别为：3.47％±0.21，4.21％±0.57，10.68％±1.57（空白对照组为0.64％±0.21），细胞凋亡率与药物作用浓度正相关（r=0.687，P＜0.01）。3．TPL单独以及联合PS-341对L428细胞的caspase9，3、PARP、Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax）表达水平的影响：5-200ng／ml TPL作用L428细胞48小时后，caspase9、3原始带随浓度的增加明显下调，而激活带明显上调；PARP原始带随浓度的增加明显下调，而激活带明显上调。Bcl-2表达水平随药物的浓度增加而显著下调，Bax表达水平则上调，光密度扫描示Bcl-2的蛋白表达水平与TPL作用浓度存在负相关，Bax的蛋白表达水平与TPL作用浓度呈正相关。提示TPL可能通过线粒体途径以及改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表达比例，促使细胞色素C等多种凋亡因子的释放诱导霍奇金淋巴瘤细胞凋亡。5ng／mlTPL联合80ng／mlPS-341作用L428细胞24小时，caspase9、3原始带在联药处理后明显下调，而激活带明显上调；PARP原始带在联药处理后明显下调，而激活带明显上调。Bcl-2表达水平在联药处理后显著下调，Bax表达水平则上调，提示TPL与PS-341可能协同通过线粒体途径以及改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表达比例，促使细胞色素C等多种凋亡因子的释放诱导霍奇金淋巴瘤细胞凋亡。[小结]1．在体外，TPL可抑制霍奇金淋巴瘤细胞株L428细胞的生长，并呈浓度依赖性，联合PS-341可以增强TPL对L428细胞的抑制作用；2．5—500ng／ml TPL处理48h后可明显诱导L428细胞的凋亡，并呈浓度依赖性，联合PS-341可以增强TPL对L428细胞的诱导凋亡；3．TPL作用L428细胞48小时后，caspase3、9原始带随浓度的增加明显下调，而激活带明显上调；PARP原始带随浓度的增加明显下调，而激活带明显上调；Bcl-2表达水平随药物的浓度增加而显著下调，Bax表达水平则上调。提示TPL可能通过线粒体途径以及改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表达比例，促使细胞色素C等多种凋亡因子的释放诱导霍奇金淋巴瘤细胞凋亡；4．TPL联合PS-341作用L428细胞24小时，caspase3、9原始带在联药处理后明显下调，而激活带明显上调；PARP原始在联药处理后明显下调，而激活带明显上调；Bcl-2表达水平在联药处理后而显著下调，Bax表达水平则上调。提示TPL与PS-341可能协同通过线粒体途径以及改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表达比例，促使细胞色素C等多种凋亡因子的释放诱导霍奇金淋巴瘤细胞凋亡。结果也提示PS-341在一定的浓度范围可增强TPL的诱导凋亡作用。