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糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病最常见的慢性并发症。中药附子作为一味广为人知的传统中药材,目前其治疗DPN均以复方形式。为了更好的研究中药附子治疗DPN的作用与机制,本论文主要进行了单味中药附子对DPN的活性物质基础及其机制的研究,为附子单味药治疗DPN提供了一定的理论依据。此外,鉴于同类成分质谱裂解一般呈现一定的规律性,本论文还总结了附子所含主要成分乌头碱类生物碱的质谱裂解规律,并基于这一规律及液相色谱与多级质谱联用技术快速分析了同属其他中药及中药炮制品中的乌头碱类成分。所得数据为中药进一步研究的提供帮助。本论文的实验内容和研究结果如下:一、附子水提物对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠以及高糖刺激雪旺细胞的保护作用研究体内实验:将36只SD雄性大鼠随机分为空白对照组,弥可保阳性药对照组,链脲佐菌素诱导6周后的糖尿病周围神经病变模型组以及中、高、低剂量给药组。附子水提物连续治疗2周,监测过程中血糖和体重的变化以及治疗后的运动神经传导速率、热刺激回缩潜伏期的变化。结果显示,在为期2周的治疗后附子水提物与阳性药弥可保对糖尿病周围神经病变大鼠的体重、血糖均无显著影响,但附子水提物可显著加快模型组大鼠神经传导速率并缩短其热刺激潜伏期,且对神经传导速率的作用效果优于阳性药组。体外实验:将雪旺细胞分为正常组、甘露醇渗透压对照组、高糖刺激的雪旺细胞模型组以及附子水提物3个剂量的治疗组(O.1μg/mL,1.0μg/mL,10.0μg/mL)。以活性氧水平变化和凋亡抑制率为指标,观察了附子水提物对高糖刺激雪旺细胞的保护作用,结果显示,高糖刺激可以引起雪旺细胞活性氧水平升高,并诱发细胞凋亡,药物作用48h后,其细胞内活性氧水平和凋亡率可显著降低,从而确定其对周围神经细胞的保护作用。因此,通过体内外实验可以推断附子单味药具有治疗糖尿病周围神经病变的作用,并且其治疗作用可能与其降低雪旺细胞内活性氧水平和抑制雪旺细胞凋亡相关。二、附子水提物中生物碱和多糖类成分的提取分离与鉴别通过柱色谱,制备色谱技术对附子水提物进行系统的化学成分分离和纯化,得到宋果灵、尼奥灵、附子灵、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头碱共6个的生物碱。同时,通过水提醇沉及脱蛋白处理得到附子水提物中的多糖组分,经苯酚-浓硫酸法进行多糖含量测定为70.24%,并应用PMP-衍生化对其单糖组成进行HPLC-MSn分析。从中发现9个单糖,其中7个被识别,岩藻糖为首次报道。另外,特征碎片离子峰m/z 215被确定为单糖的诊断离子。三、基于氧化应激机制的体外活性成分筛选与抗氧化机制的初步研究附子水提物分离得到生物碱单体和多糖组分后,利用高糖刺激雪旺细胞ROS清除实验进行附子水提物中活性成分的筛选工作,并对筛选出的成分进一步进行相应的凋亡率检测。结果表明:生物碱单体中尼奥灵可以抑制高糖刺激RSC96细胞引起的活性氧水平但没有明显的剂量依赖性;而苯甲酰乌头原碱仅在高浓度时才显示出了活性氧抑制作用,其他生物碱则无抗氧化作用显示,提示附子生物碱抗氧化作用较弱,可能不是附子水提液抗氧的主要活性成分;附子多糖显示出显著的抗氧化活性,且呈现剂量依赖性;在细胞凋亡检测中,三个浓度均能使凋亡率到达正常水平。由此初步推断,附子多糖为附子抗氧化的主要活性物质。为了阐明附子多糖的抗氧化机制,课题运用Western blot技术测定了与活性氧产生直接相关的NADPH氧化酶类Nox1、与抗氧化直接相关的抗氧化酶CAT和SOD、以及促抗氧化酶表达和线粒体生成的信号通路AMPK-PGC-1α中主要蛋白的表达量,结果显示多糖可以降低Nox1的蛋白表达但没有明显剂量依赖;仅在高浓度时显示促进CAT、SOD蛋白的表达且对SOD表达较CAT明显;多糖可以显著激活AMPK,使其磷酸化比例增加,同时PGC-1α的表达也明显增多且具有剂量依赖性。因此,附子多糖可以通过增加抗氧化酶的表达和抑制Nox1氧化活性蛋白表达发挥其抗氧化作用,且AMPK-PGC-1α信号通路,可能是其改善雪旺细胞内氧化还原平衡状态的重要分子途径。四、乌头碱类成分的快速识别在研究乌头类生物碱的过程中发现,通过质谱分析乌头碱类单体成分呈现出易于逐个或连续丢失CH3COOH、CH3OH、C2H4、CO、H2O等中性分子的质谱裂解规律。基于这一规律和液质联用技术,来源于乌头属植物的藏药藏铁锤中的乌头碱类化学成分在反相色谱柱上被快速分离和识别,从中发现42个生物碱,其中38个被识别,29个生物碱为首次报道。通过类似的方法,草乌炮制(110℃下烘制8小时)前后的乌头类生物碱化学成分变化被识别。在生品中共检测到32个生物碱成分,其中26个成分被识别,而在烘制品中检测到了 24个生物碱成分,20个被识别。比较发现炮制前含有的7个毒性强的双酯型生物碱在炮制后均未出现,而炮制后新出现的11成分多为毒性较低的单酯和胺醇型生物碱。因此,从成分变化的角度分析,草乌烘制法具有良好的炮制减毒作用。